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动物行为与光电专题(30)丨自由活动小鼠痫样钙信号记录

选用SPF级别8~12周的雄性C57BL/6小鼠作为实验对象,体重20~25g,动物饲养环境为:12h明/12h暗交替,湿度50±10%,室温23±2℃,环境安静且无异味。新购入的小鼠需在上述环境中适应3~5天后再进行实验。

每只动物分别进行不同麻醉浓度,清醒自由活动和腹腔注射10mg/kg剂量的KA溶液诱发急性痫样发作状态,海马CA1和初级运动皮层M1钙信号的同时记录。统计对比为自身前后对照,至少保证6只小鼠是符合实验需求的有效样本。有效样本需同时满足以下条件:(1)钙离子指示剂Cal-520AM负载位置准确;(2)植入光纤位置准确;(3)光纤固定稳定,即小鼠自由活动时正常自发钙信号不受运动的影响;(4)腹腔注射KA后急性痫样发作等级达到CMS。

多模光纤束中的光纤排列在一根陶瓷插芯中,激发光由光源(LED)射出,通过二向色镜反射后由物镜耦合到多根光纤中,多根光纤在末端分开,可以将激发光传至同一小鼠不同脑区或多只不同小鼠。目标脑区中的荧光信号经同一根光纤传回至探测光路,CMOS以图像方式采集,通过软件处理显示为多路不同的钙信号。

Fig1 多通道光纤系统原理示意图

两个脑区光纤植入均完成后,在异氟烷浓度为0.8%和1.2%时,同时记录两个脑区的钙信号。每个浓度各记录10min,一个浓度记录完成后,调整麻醉至另一浓度,让实验小鼠在另一浓度适应30min后再记录。麻醉状态下的钙信号记录完成后,将小鼠撤离麻醉,放入透明圆形的玻璃缸中恢复1.5h以上,当其自由活动和探索行为正常时,则认为是脱离了异氟烷的影响。记录动物清醒自由活动的信号同时,用高清摄像头同时录制小鼠的行为学视频,过程持续15min。后采用腹腔注射10mg/kg剂量KA溶液的方式诱发急性痫样模型,同步记录痫样模型中实验小鼠两个脑区钙信号和行为学变化,过程持续1.5h。全部实验过程用录屏软件将钙信号记录和行为学视频同步录制,以便后续的处理和分析。

小鼠急性痫样发作的行为学评价标准:

根据改进的Racine分级法则对小鼠痫样发作的行为学进行严重程度分级:

0级:正常活动;

Ⅰ级:停止活动,呆滞;

Ⅱ级:耸肩,面部、前肢不自主运动;

Ⅲ级:直立,面部、前肢不自主运动和持续地前肢痉挛;

Ⅳ级:反复直立跌倒,双侧前肢阵挛;

Ⅴ级:胡乱跑动、蹿跳或侧卧强直阵挛性抽搐。

Ⅲ级以上发作被称为CMS,达到CMS的小鼠纳入实验统计样本。

不同麻醉浓度的钙活动记录完成后,将实验小鼠撤离麻醉状态,放入透明玻璃缸中恢复1.5h。待小鼠恢复正常自由活动和空间探索行为后,则认为已经脱离了异氟烷的相关影响,开始记录清醒自由活动状态下的信号。

Fig2 清醒自由活动小鼠钙信号记录和视频录制示意图

清醒自由活动状态下的钙信号相较于麻醉浓度0.8%条件下的钙信号,活动更为频繁,且此时观察不到海马CA1和初级运动皮层M1之间自发信号的明显同步性与否。猜测可能是因为,在自由活动状态中,动物不同脑区各司其职,因为不同的功能所以有不同的钙活动表现。而在麻醉状态下,由于异氟烷对神经细胞活动的抑制作用,使不同脑区的钙信号趋于同步。

急性痫样状态钙活动与行为学发作的关系:

清醒自由活动状态下,小鼠在记录装置中表现正常,有生理状态下的洗脸、理毛、直立等探索行为。正常活动时,运动基本不会对钙波造成影响,钙活动基线平稳,无明显的大波出现。

Fig3 小鼠清醒自由活动状态下行为学活动和钙信号记录视频

腹腔注射10mg/kg剂量的KA溶液诱导急性痫样发作。以下以一只实验动物为例描述痫样钙信号与行为学发作之间的关系。

Fig4 实验小鼠急性痫样状态钙信号记录1.5h

举例实验动物在给药后1.5h内一共出现了8次多数同步的痫样钙信号。波形1出现时,小鼠开始表现为1级呆滞不动,后从记录容器的中间挪动到边缘靠壁,并略有前肢不自主运动,发作等级在1~2级之间。在波形2出现前一直表现为呆滞状态。

波形2出现时,M1的信号表现为直接上升后下降,CA1的信号表现为先有一个较小的高频脉冲式钙波的钙积聚build-up,然后接着出现CSD样的大型平滑钙波。CA1的build-up部分和与之对应的M1波形出现时,小鼠发作等级升高到3级,即表现为直立,面部、前肢不自主运动和持续性的前肢痉挛,但当CSD样的大型平滑钙波出现时,小鼠发作等级降回1~2级,不再直立,仅表现呆滞和偶尔面部、前肢的不自主运动。

在波形3出现前,小鼠主要表现为1~2级发作的呆滞,偶尔头部和前肢的痉挛和偶尔的位移。

波形3出现时,小鼠表现为半直立,头部和左前肢不自主运动和痉挛,处在2~3级发作间。波形3结束至在波形4出现前,小鼠主要表现为1~2级呆滞,偶尔头部和前肢的痉挛。

波形4出现时,在CA1出现build-up和M1出现对应较小钙波时,小鼠表现为半直立,耸肩,头部和左前肢明显剧烈抽搐的3级以上发作;当CA1中CSD样大型钙波出现时,小鼠恢复到2级发作,仅面部和前肢不自主运动;当M1有CSD样大型钙波出现时,小鼠表现出头至肩部的明显抽搐,双侧前肢的持续痉挛,甚至有跌倒的趋势,达到3~4级发作。波形下降至结束时,小鼠恢复到1级呆滞和偶尔头部和前肢不自主运动状态。在M1CSD样大波后的小波和CA1非CSD样小波对应出现时,小鼠表现出明显的直立,面部前肢不自主抽搐和前肢持续痉挛,再次达到3~4级发作;波形结束后恢复到1级呆滞和偶尔不自主运动状态。在波形5出现前,小鼠持续表现为呆滞和偶尔前肢的不自主抽搐。

波形5出现时,一开始CA1先于M1出现基线平稳的高频脉冲样波形,此时小鼠保持呆滞和前肢的不自主运动,发作在1~2级之间;当M1和CA1同时出现非CSD样波形时,小鼠直立,双侧前肢剧烈痉挛,达到3~4级发作;钙波降回基线后小鼠的发作表现稍微减轻,表现为坐姿,但仍持续2~3级发作,直

到波形6出现。波形6出现时,一开始CA1先于M1出现基线平稳的高频脉冲样波形,此时小鼠的发作与波形5至波形6之间发作表现相同;当M1和CA1同时出现非CSD样波形时,小鼠直立,抽搐明显更加剧烈,抽搐频率加快,达到3~4级发作;当钙波降回基线后,发作表现稍微减轻,表现为坐姿,但仍持续2~3级发作,直到波形7出现。

波形7出现时,一开始CA1先于M1出现基线平稳的高频脉冲样波形,此时小鼠的发作与波形6至波形7之间发作表现相同;当M1出现非CSD样钙波同时CA1钙波基线开始上升时,小鼠出现明显抽搐加剧,随后出现蹿跳和反复直立跌倒,达到5级发作。当M1波形下降,CA1中CSD样波形开始上升时,小鼠发作等级减缓,恢复到直立和双侧前肢痉挛的4级发作;当CA1中CSD样波形恢复到基线后,小鼠发作表现逐渐减缓至2~3级的前肢不自主抽搐。

急性痫样发作后期,实验小鼠海马CA1脑区开始出现一直持续的基线平稳的高频脉冲样波形(波形8),但初级运动皮层M1的钙信号没有明显变化。当这种高频脉冲样波形出现时,小鼠也一直维持着2~3级的发作状态没有明显的变化。在此急性痫样模型中,小鼠达到CMS。

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