动物行为与光电专题（30）丨自由活动小鼠痫样钙信号记录

选用SPF级别8~12周的雄性C57BL/6小鼠作为实验对象，体重20~25g，动物饲养环境为：12h明/12h暗交替，湿度50±10%，室温23±2℃，环境安静且无异味。新购入的小鼠需在上述环境中适应3~5天后再进行实验。

每只动物分别进行不同麻醉浓度，清醒自由活动和腹腔注射10mg/kg剂量的KA溶液诱发急性痫样发作状态，海马CA1和初级运动皮层M1钙信号的同时记录。统计对比为自身前后对照，至少保证6只小鼠是符合实验需求的有效样本。有效样本需同时满足以下条件：（1）钙离子指示剂Cal-520AM负载位置准确；（2）植入光纤位置准确；（3）光纤固定稳定，即小鼠自由活动时正常自发钙信号不受运动的影响；（4）腹腔注射KA后急性痫样发作等级达到CMS。

多模光纤束中的光纤排列在一根陶瓷插芯中，激发光由光源（LED）射出，通过二向色镜反射后由物镜耦合到多根光纤中，多根光纤在末端分开，可以将激发光传至同一小鼠不同脑区或多只不同小鼠。目标脑区中的荧光信号经同一根光纤传回至探测光路，CMOS以图像方式采集，通过软件处理显示为多路不同的钙信号。

Fig1 多通道光纤系统原理示意图

两个脑区光纤植入均完成后，在异氟烷浓度为0.8%和1.2%时，同时记录两个脑区的钙信号。每个浓度各记录10min，一个浓度记录完成后，调整麻醉至另一浓度，让实验小鼠在另一浓度适应30min后再记录。麻醉状态下的钙信号记录完成后，将小鼠撤离麻醉，放入透明圆形的玻璃缸中恢复1.5h以上，当其自由活动和探索行为正常时，则认为是脱离了异氟烷的影响。记录动物清醒自由活动的信号同时，用高清摄像头同时录制小鼠的行为学视频，过程持续15min。后采用腹腔注射10mg/kg剂量KA溶液的方式诱发急性痫样模型，同步记录痫样模型中实验小鼠两个脑区钙信号和行为学变化，过程持续1.5h。全部实验过程用录屏软件将钙信号记录和行为学视频同步录制，以便后续的处理和分析。

小鼠急性痫样发作的行为学评价标准:

根据改进的Racine分级法则对小鼠痫样发作的行为学进行严重程度分级：

0级：正常活动；

Ⅰ级：停止活动，呆滞；

Ⅱ级：耸肩，面部、前肢不自主运动；

Ⅲ级：直立，面部、前肢不自主运动和持续地前肢痉挛；

Ⅳ级：反复直立跌倒，双侧前肢阵挛；

Ⅴ级：胡乱跑动、蹿跳或侧卧强直阵挛性抽搐。

Ⅲ级以上发作被称为CMS，达到CMS的小鼠纳入实验统计样本。

不同麻醉浓度的钙活动记录完成后，将实验小鼠撤离麻醉状态，放入透明玻璃缸中恢复1.5h。待小鼠恢复正常自由活动和空间探索行为后，则认为已经脱离了异氟烷的相关影响，开始记录清醒自由活动状态下的信号。

Fig2 清醒自由活动小鼠钙信号记录和视频录制示意图

清醒自由活动状态下的钙信号相较于麻醉浓度0.8%条件下的钙信号，活动更为频繁，且此时观察不到海马CA1和初级运动皮层M1之间自发信号的明显同步性与否。猜测可能是因为，在自由活动状态中，动物不同脑区各司其职，因为不同的功能所以有不同的钙活动表现。而在麻醉状态下，由于异氟烷对神经细胞活动的抑制作用，使不同脑区的钙信号趋于同步。

急性痫样状态钙活动与行为学发作的关系：

清醒自由活动状态下，小鼠在记录装置中表现正常，有生理状态下的洗脸、理毛、直立等探索行为。正常活动时，运动基本不会对钙波造成影响，钙活动基线平稳，无明显的大波出现。

Fig3 小鼠清醒自由活动状态下行为学活动和钙信号记录视频

腹腔注射10mg/kg剂量的KA溶液诱导急性痫样发作。以下以一只实验动物为例描述痫样钙信号与行为学发作之间的关系。

Fig4 实验小鼠急性痫样状态钙信号记录1.5h

举例实验动物在给药后1.5h内一共出现了8次多数同步的痫样钙信号。波形1出现时，小鼠开始表现为1级呆滞不动，后从记录容器的中间挪动到边缘靠壁，并略有前肢不自主运动，发作等级在1~2级之间。在波形2出现前一直表现为呆滞状态。

波形2出现时，M1的信号表现为直接上升后下降，CA1的信号表现为先有一个较小的高频脉冲式钙波的钙积聚build-up，然后接着出现CSD样的大型平滑钙波。CA1的build-up部分和与之对应的M1波形出现时，小鼠发作等级升高到3级，即表现为直立，面部、前肢不自主运动和持续性的前肢痉挛，但当CSD样的大型平滑钙波出现时，小鼠发作等级降回1~2级，不再直立，仅表现呆滞和偶尔面部、前肢的不自主运动。

在波形3出现前，小鼠主要表现为1~2级发作的呆滞，偶尔头部和前肢的痉挛和偶尔的位移。

波形3出现时，小鼠表现为半直立，头部和左前肢不自主运动和痉挛，处在2~3级发作间。波形3结束至在波形4出现前，小鼠主要表现为1~2级呆滞，偶尔头部和前肢的痉挛。

波形4出现时，在CA1出现build-up和M1出现对应较小钙波时，小鼠表现为半直立，耸肩，头部和左前肢明显剧烈抽搐的3级以上发作；当CA1中CSD样大型钙波出现时，小鼠恢复到2级发作，仅面部和前肢不自主运动；当M1有CSD样大型钙波出现时，小鼠表现出头至肩部的明显抽搐，双侧前肢的持续痉挛，甚至有跌倒的趋势，达到3~4级发作。波形下降至结束时，小鼠恢复到1级呆滞和偶尔头部和前肢不自主运动状态。在M1CSD样大波后的小波和CA1非CSD样小波对应出现时，小鼠表现出明显的直立，面部前肢不自主抽搐和前肢持续痉挛，再次达到3~4级发作；波形结束后恢复到1级呆滞和偶尔不自主运动状态。在波形5出现前，小鼠持续表现为呆滞和偶尔前肢的不自主抽搐。

波形5出现时，一开始CA1先于M1出现基线平稳的高频脉冲样波形，此时小鼠保持呆滞和前肢的不自主运动，发作在1~2级之间；当M1和CA1同时出现非CSD样波形时，小鼠直立，双侧前肢剧烈痉挛，达到3~4级发作；钙波降回基线后小鼠的发作表现稍微减轻，表现为坐姿，但仍持续2~3级发作，直

到波形6出现。波形6出现时，一开始CA1先于M1出现基线平稳的高频脉冲样波形，此时小鼠的发作与波形5至波形6之间发作表现相同；当M1和CA1同时出现非CSD样波形时，小鼠直立，抽搐明显更加剧烈，抽搐频率加快，达到3~4级发作；当钙波降回基线后，发作表现稍微减轻，表现为坐姿，但仍持续2~3级发作，直到波形7出现。

波形7出现时，一开始CA1先于M1出现基线平稳的高频脉冲样波形，此时小鼠的发作与波形6至波形7之间发作表现相同；当M1出现非CSD样钙波同时CA1钙波基线开始上升时，小鼠出现明显抽搐加剧，随后出现蹿跳和反复直立跌倒，达到5级发作。当M1波形下降，CA1中CSD样波形开始上升时，小鼠发作等级减缓，恢复到直立和双侧前肢痉挛的4级发作；当CA1中CSD样波形恢复到基线后，小鼠发作表现逐渐减缓至2~3级的前肢不自主抽搐。

急性痫样发作后期，实验小鼠海马CA1脑区开始出现一直持续的基线平稳的高频脉冲样波形（波形8），但初级运动皮层M1的钙信号没有明显变化。当这种高频脉冲样波形出现时，小鼠也一直维持着2~3级的发作状态没有明显的变化。在此急性痫样模型中，小鼠达到CMS。