Mol Cell | 李壮团队揭示I型Cascade变体复合物精准切割靶DNA的工作机理

引言

CRISPR-Cas系统广泛存在于细菌和古细菌中，用于抵抗外来核酸的入侵。CRISPR-Cas系统目前可以划分成两大类7种类型，其中I型是原核生物中存在丰度最高的类型，且包含多种亚型（I-A到I-G）。I型系统通过形成Cascade 复合物，并招募Cas3核酸酶来实现对靶DNA的降解。

最新的生物信息学研究发现了两个I型变体系统（此处命名为I-EHNH和I-FHNH），它们都缺乏Cas3核酸酶但却在核心亚基上融合了 HNH核酸酶结构域，以实现对靶DNA的切割。这两种系统都可以通过重编程在哺乳动物细胞中产生突变，显示出了巨大的基因组编辑潜力。然而，它们依赖PAM和crRNA引导产生位点特异的DNA切割的工作机制仍不清楚。

2024年7月23日，湖北大学李壮团队在Molecular Cell杂志上发表了题为Mechanisms for HNH-mediated target DNA cleavage in type I CRISPR-Cas systems的研究论文。该研究发现，crRNA介导的靶DNA定位和靶DNA诱导的HNH构象变化是其精准切割靶DNA的关键因素。

该研究的具体发现如下：

1）Type I-FHNHCascade复合物结构。总体而言，type I-FHNHCascade变体复合物与type I-F Cascade常规复合物有高度的结构相似性，均呈现类似海马的结构，且都由Head、Backbone、Tail部分组成。不同的是，在变体复合物中，HNH结构域取代了常规复合物中Helical Bundle结构域的位置，且恰好临近靶DNA与crRNA配对区域之外的5’末端。

2）Type I-FHNHCascade复合物的激活机制。在靶DNA未结合的状态下，HNH结构域和Cas6f相互作用，维持相对稳定的状态，此时HNH结构域的催化位点朝向外侧。随着PAM序列被正确识别以及由crRNA和靶DNA组成的R-loop的完全形成，Cascade复合物的Head区域向外偏移，使得HNH结构域发生约150度的旋转，容纳并切割靶DNA的目标链。进一步的结构观察发现，HNH结构域的切割关键氨基酸指向了靶DNA切割位点对应的磷酸骨架。

3）Type I-EHNHCascade复合物结构。Type I-EHNHCascade变体复合物也与type I-E Cascade常规复合物具有高度的相似性，均呈现海马样结构。常规复合物的结构由外层和内层组成，外层由Head 、Backbone、Tail部分组成，内层由两个Cas11e分子组成。变体复合物与常规复合物的不同在于内层结构，HNH结构域取代了一个Cas11e分子的位置，且恰好临近靶DNA与crRNA配对区域之外的5’末端。

4）Type I-EHNHCascade复合物的激活机制。靶DNA与crRNA的结合使得I-EHNHCascade复合物的head区域（包括HNH结构域和Cas6e）发生外移，使得由Cas11e和HNH结构域形成的孔道变宽， 使靶DNA得以进入并被HNH的催化中心切割。与type I-FHNHCascade类似，结构观察到的潜在切割位点与测序分析得到的靶DNA切割位点一致。

通过比较这两个变体复合物的工作机理，可以发现一系列的共性。首先，它们的HNH结构域均处于靠近靶DNA与crRNA 配对区域之外的5’末端，以便于靶DNA进入其活性位点。其次，靶DNA的目标链与crRNA完全配对结束后，都需要转弯进入HNH的活性中心。第三，靶DNA和crRNA完全配对引发了变体复合物部分亚基的移动，但并不造成HNH结构域活性中心的构象变化。两者工作机理上的共性更好地揭示了HNH核酸酶结构域如何通过整合到一个庞大的复合物基座上，以实现对靶DNA的精准切割。

模式图(Credit:Molecular Cell)

总的来说，本研究通过系统的结构和生化研究，阐明融合了HNH核酸酶结构域的I型CRISPR-Cas变体系统的工作机理，为进一步的基因编辑应用和优化开发做了铺垫。

参考文献

责编|探索君

排版|探索君