人肾素（Renin）ELISA ：微观世界的浓度探秘

一、神奇的实验原理

实验前，抗人肾素抗体早已在微孔酶标板这个 “秘密基地” 设下了巧妙的 “陷阱”。当加入人肾素校准品和待测样本时，人肾素就像调皮的 “小目标”，一头扎进抗体的 “怀抱”，与之紧密结合。紧接着，HRP 标记的抗人肾素抗体也赶来 “聚会”，三者共同形成了一个稳固的 “夹心复合物”。经过一番温育和彻底洗涤，把那些游离的 “小喽啰” 都清扫出去。随后加入底物 A 和 B，在 HRP 这位神奇 “魔法师” 的催化下，底物从无色摇身一变成为蓝色，再加入终止液（2M 硫酸），瞬间又变成了黄色。奇妙的是，黄色的深浅与样本中人肾素的浓度成正比。最后，通过酶标仪这位 “数据大师” 在 450nm 波长下测定吸光度（OD 值），就能计算出样本中人肾素的浓度啦。

二、实验前的精心筹备

“唤醒” 试剂盒与样本：实验前 2 小时，要将试剂盒和样本从冰箱这个 “冰窖” 中解救出来，让它们在室温下尽情 “舒展”，充分适应环境。这一步至关重要，就好比让运动员提前热身，能保证后续实验的顺利进行。

洗涤液的准备：从冰箱拿出的浓缩洗涤液若出现结晶，别慌张，这就如同冬天湖面结冰，是正常现象。只需将其放在温水里泡一泡，结晶便会融化。接着，按照 1:20 的比例，将 1 份浓缩洗涤液与 19 份蒸馏水混合，就得到了可用的洗涤液。

底物的调配：底物液 A 和 B 在使用前，需按 1:1 的体积充分混合，并且要在 15 分钟内尽快使用，不然它们就会 “罢工”，影响实验效果。

三、不可或缺的实验 “小伙伴”

酶标仪（450nm），宛如一位精准的 “数据记录员”，能准确测量并记录关键数据。

精密移液器及一次性吸头，它们是加样的 “神枪手”，确保每一次加样都精准无误。

蒸馏水，作为实验中的 “得力助手”，发挥着不可或缺的作用。

洗瓶或者自动洗板机，承担着清洗的重任，是实验的 “清洁小卫士”。

37℃水浴锅或恒温箱，为实验提供了一个温暖舒适的 “小窝”。

500ml 量筒，用于量取液体，是实验中的 “小量具”。

四、样品的采集与妥善储存

细胞培养上清：将细胞培养上清在 4000rpm 的转速下离心 20 分钟，去除细胞颗粒和聚合物这些 “小麻烦” 后，将上清液存放在 - 20℃以下的 “大冷库” 中，并且要避免反复冻融，否则样本可能会 “发脾气”，影响实验结果。

血清：使用不含热原和内毒素的试管收集血液，操作过程中要小心，避免刺激细胞。随后在 4000rpm 的转速下离心 20 分钟，小心翼翼地分离出血清，同样存放在 - 20℃以下的 “大冷库”，防止反复冻融。

血浆：选用肝素、EDTA 或柠檬酸钠作为抗凝剂，在 4000rpm 的转速下离心 20 分钟取上清，血浆也要放在 - 20℃以下的 “大冷库” 保存，杜绝反复冻融的情况。

组织匀浆：先用预冷的 PBS 给组织洗个 “冷水澡”，去除残留血液，称好重量后将组织剪碎。按照 1:9 的比例，把剪碎的组织和 PBS（加入蛋白酶抑制剂这个 “小帮手”）放入玻璃匀浆器中，在冰上使劲研磨。要是想让组织细胞碎得更彻底，还可以对匀浆液进行超声破碎或反复冻融。最后在 5000×g 的转速下离心 5 - 10 分钟，取上清用于检测。

细胞提取液：贴壁细胞先用冷的 PBS 轻轻清洗，再用胰蛋白酶消化，然后在 1000×g 的转速下离心 5 分钟收集细胞；悬浮细胞则可直接离心收集。收集到的细胞用冷的 PBS 洗涤 3 次，每 1×106 个细胞加入 150 - 200μL PBS 重新悬浮起来，通过反复冻融让细胞 “散架”（若含量很低，PBS 的体积可适当减少）。最后在 1500×g 的转速下离心 10 分钟，取上清检测。

其他生物体液：在 1000×g 的转速下离心 20 分钟，除去杂质及细胞碎片这些 “小障碍”，取上清进行检测。

五、关键的操作步骤

准备工作液：参照说明书的详细方法，将试剂盒各种组分的工作液一一配制好，这就像是为一场精彩演出准备好所有道具。

取出板条：从铝箔袋中取出本次实验所需的板条，剩余的板条要用自封袋密封好，放回冰箱，就像把暂时不用的宝贝妥善收藏起来。

设置孔位：设置标准品孔、0 值孔、空白孔和样本孔。标准品孔各加入不同浓度的标准品 50μL，0 值孔加入样本稀释液 50μL，空白孔则什么都不加，样本孔加入待测样本 50μL。

加入检测抗体：除空白孔外，在标准品孔、0 值孔和样本孔中加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体 100μL，如同为实验注入了神奇的 “魔法药水”。

温育反应：用封板膜将反应板严严实实地盖住，在 37℃水浴锅或恒温箱中避光孵育 60 分钟，让各种物质在这个温暖的 “小房间” 里充分反应。

洗板环节：揭开封板膜，将液体倒掉，在吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置 20 秒，再把洗涤液甩出去，在吸水纸上拍干，如此重复 5 次。如果使用自动洗板机，要按照操作程序进行洗板，别忘了添加一个 30 秒浸泡的步骤，这能大大提高检测的精度。洗板结束，加底物前，要在干净不掉屑的纸上将反应板充分拍干，确保没有残留的杂质干扰后续实验。

加入底物：将底物 A 和 B 按 1:1 的体积充分混合后，在所有孔中加入底物混合液 100μL。然后再次用封板膜盖住反应板，在 37℃水浴锅或恒温箱中避光孵育 15 分钟，见证神奇的显色时刻。

加入终止液并读数：在所有孔中加入终止液 50μL，之后在酶标仪 450nm 波长上读取各孔的吸光度（OD 值），这些数据将成为我们解开人肾素浓度之谜的关键线索。

六、巧妙的结果计算

绘制标准曲线：以标准品浓度作为横坐标（6 个标准品孔加上 1 个 0 值孔，共 7 个浓度点），对应的吸光度（OD 值）作为纵坐标，借助计算机软件，采用四参数 Logistic 曲线拟合（4 - pl）的方法，创建标准曲线方程。这就好比绘制一幅精确的地图，为我们找到样本中人肾素的浓度指明方向。

计算浓度：通过样本的吸光度（OD 值），利用上述创建的方程计算出样品的浓度值。如果样品在实验前被稀释过，那么最终的浓度值还需要乘以稀释倍数，这样才能得到样品中真实的人肾素浓度。

七、贴心的注意事项

试剂盒使用规则：必须在试剂盒标示的有效期内使用，过期产品坚决不能用。而且不能与其他厂家的试剂盒或组分混用，要使用本试剂盒配套的样品稀释液，严格遵循这些规则，才能保证实验的准确性。

实验操作要点：混合蛋白溶液时要小心，避免产生气泡。加校准品与样本时，每个校准品浓度和样本都要更换新的移液枪头，公共组分应采用悬臂加样的方式，防止交叉污染。合适的温育时间和充分的洗涤步骤是保证实验结果准确的关键，千万不能马虎。使用自动洗板机时，一定要加入 30 秒浸泡的步骤。如果底物溶液在保存过程中变成蓝色，那就意味着它已经失效，不能再使用了。终止液的加样顺序要与底物溶液的加样顺序一致，加入终止液后，蓝色底物产物会瞬间变为黄色。实验中用剩的板条，要立刻放回自封袋中，密封好（保持低温干燥）保存。所有液体组分，在使用前都要充分摇匀，并且严格按照说明书标明的时间、加样量及加样顺序进行温育操作。

生物安全提示：整个检测过程必须符合实验室管理规范的要求，严格防止交叉污染。所有样品、洗弃液和各种废弃物都要按照传染物的标准进行妥善处置。试剂盒的液体组分中含有 proclin - 300 防腐剂，可能会引起皮肤过敏反应，所以要避免吸入其烟雾，同时也要防止与皮肤接触。底物液对皮肤、眼睛和上呼吸道有刺激作用，同样要避免吸入烟雾。在实验过程中，一定要戴上防护手套，实验完成后要彻底洗手，确保自身安全。