经典微小说：《且慢下手》

摘在生态毒理学受试生物研究上，国内外已经开发了多种受试生物品种，如斑马鱼，大型溞，浮萍，虹鳟，反映水污染现状。 本研究通过Illumina测序技术获取河蚬miRNAs信息，为研究miRNA在环境毒理学上的应用提供了基础。利用RACE技术，克隆典型河蚬肠促胰酶肽（Cholecystokinin），Conopressin神经肽和FF神经肽基因，并进一步选取了具有神经毒性的污染物有机磷酸酯，筛查敏感的神经肽标志物，为神经肽的毒理学研究与应用提供了科学依据。使用转录组测序技术评估TDCPP和TBP对河蚬内脏团的毒理机制，为我国对TDCPP和TBP的风险评估提供依据。本论文的技术路线如图1-1。 图1-1 本论文的技术路线  第二章 基于Solexa技术的河蚬保守和新microRNA的鉴定与特征分析 2.1 引言 河蚬作为我国本土淡水贝类是生态毒理学研究的优势物种，陈辉辉等[142]通过转录制测序发现了一些环境标志物基因，如cyp30, hsp70, GABARAP, TPX1, 和SOD。但是目前还没有河蚬环境相关miRNAs的报道。 因此在本研究中，我们使用Solexa测序技术鉴定了河蚬中的miRNAs。此外还使用荧光定量PCR测定了特定miRNA转录本在不同组织中的表达情况，两种法则被用来预测miRNAs的潜在目标，本研究提供了河蚬miRNAs数据，为以后研究河蚬miRNAs的生物学功能和进化提供了技术。 2.2 材料和方法 2.2.1 河蚬的养殖 河蚬取自洪泽湖，养殖方法见附录1 2.2.2 miRNA的提取与测序 首先使用天根miRcute miRNA提取分离试剂盒对河蚬miRNA进行提取，然后在3’和5’接头加上测序序列，接着进行反转，建库，PCR扩增，使用聚丙烯酰胺凝胶分离纯化145-160nt的小RNA，加接头，最后上机测序。提取与测序流程如图2-1。 图2-1 miRNA库建立与测序 2.2.3 miRNA测序数据生物信息学分析 由Solexa测序产生的单个序列通过FASTX工具进行数据过滤，评估序列质量去除低质量序列和3’接头，5’接头和多A序列，计算小RNA长度分布[143, 144]。余下的干净序列使用blast搜索比对到牡蛎基因组上[145]。接着使用BLASTN将有意义的匹配序列比对到Rfam数据库[17]注释rRNA，tRNA，snRNA和其他ncRNA序列。剩下的小RNA比对到miRBase 21中的后生动物成熟miRNAs库。一样或与参考的成熟miRNAs相关的序列被认为是保守miRNAs。没有匹配到任何数据库的序列被比对到牡蛎基因组用来预测新miRNAs。与牡蛎基因组没有任何差别的序列通过MIPEAP折叠来确定为潜在的新miRNAs。使用了如下法则来确定)用DEPC处理过的水和无水乙醇配制成75%乙醇，按每ml Trizol 液加入至少1ml 的比例加入75% 冰预冷的乙醇，用手轻轻上下翻转约50次，用移液器反复吸吹悬浮的沉淀。 (6)8000 g，4°C下离心5min，尽量弃上清。 (7)室温瞭干，注意不要干燥过分，然后将RNA 溶于无核酸水中。利用DNA 的紫外分光光度计检测提取的RNA样品纯度和浓度。一般OD260/OD280>1.8时，样品纯度符合要求，其余的RNA于-80℃冻存，进行反转录合成。 3.2.3.2. 去除 RNA 中的 DNA （1）用 RNase-free DNase 去除样品中DNA污染。 DNaseⅠ消化处理反应体系(20μL） RNA16μL DNaseⅠ2 μL 10×DNaseⅠ Buffer2μL Total volume 20 μL （2涡旋混匀后，37°C 水浴 30min。 （3）加入RQ1 DNase Stop Solution 1μL，混匀，瞬时离心，65°C 反应 10min。 （4）RNA浓度采用紫外分光光度计测定A260/A280 大于1.8，其余的RNA于-80℃冻存，进行反转录合成。 3.2.3.3. cDNA 第一链的合成 首先使用Multiskan GO酶标仪对提取并去除DNA污染的总RNA进行定量，使用Promeg

来源：凤凰网

最近，大多数的同仁都很兴奋，因为单位里调来一位新主管，据说是个能人，专门被派来整顿业务的。

可是日子一天天过去，新主管却毫无作为，每天彬彬有礼进办公室，便躲在里面难得出门。

那些本来紧张得要死的坏份子，现在反而更猖獗了。

他哪里是个能人嘛！根本就是个老好人，比以前的主管更容易唬！

四个月过去了，就在真正努力工作的同事为新主管感到失望时，新主管却发威了：

坏份子一律开除，能人则获得晋升。

下手之快，断事之准，与之前表现保守的他，简直像是全然换了个人。

年终聚餐时，新主管在酒过三巡之后致词：

相信大家对我新到任期间的表现，和后来的大刀阔斧，一定感到不解。

现在听我说个故事，各位就明白了。

我有位朋友，买了栋带着大院的房子。

他一搬进去，就将那院子全面整顿，杂草、树一律清除，改种自己新买的花卉。

某日，原先的屋主来访，进门大吃一惊的问：

“那最名贵的牡丹哪里去了？”

我这位朋友才发现，他竟然把牡丹当草给铲了。

后来他又买了一栋房子，虽然院子更是杂乱，他却是按兵不动。

果然——

冬天以为是杂树的植物，春天里开了繁花；

春天以为是野草的，夏天里成了锦蔟；

半年都没有动静的小树，秋天居然红了叶。

直到暮秋，它才真正认清哪些是无用的植物，而大力铲除，并使所有珍贵的草木得以保存。

说到这儿，主管举起杯来：

让我敬在座的每一位！

如果这个办公室是个花园，你们就都是其间的珍木。

珍木不可能一年到头都开花结果，只有经过长期的观察才认得出啊！

别急着对一个人下判断，短暂的相处不能让你了解一个人。一个错误的判断，可能会让你失去一个好帮手、好朋友。

无论您有多忙，请花1秒钟的时间把它放到你的圈子里！可能您的朋友就需要！谢谢！