一切看淡,一切随缘

摘在生态毒理学受试生物研究上,国内外已经开发了多种受试生物品种,如斑马鱼,大型溞,浮萍,虹鳟,反映水污染现状。 本研究通过Illumina测序技术获取河蚬miRNAs信息,为研究miRNA在环境毒理学上的应用提供了基础。利用RACE技术,克隆典型河蚬肠促胰酶肽(Cholecystokinin),Conopressin神经肽和FF神经肽基因,并进一步选取了具有神经毒性的污染物有机磷酸酯,筛查敏感的神经肽标志物,为神经肽的毒理学研究与应用提供了科学依据。使用转录组测序技术评估TDCPP和TBP对河蚬内脏团的毒理机制,为我国对TDCPP和TBP的风险评估提供依据。本论文的技术路线如图1-1。 图1-1 本论文的技术路线  第二章 基于Solexa技术的河蚬保守和新microRNA的鉴定与特征分析 2.1 引言 河蚬作为我国本土淡水贝类是生态毒理学研究的优势物种,陈辉辉等[142]通过转录制测序发现了一些环境标志物基因,如cyp30, hsp70, GABARAP, TPX1, 和SOD。但是目前还没有河蚬环境相关miRNAs的报道。 因此在本研究中,我们使用Solexa测序技术鉴定了河蚬中的miRNAs。此外还使用荧光定量PCR测定了特定miRNA转录本在不同组织中的表达情况,两种法则被用来预测miRNAs的潜在目标,本研究提供了河蚬miRNAs数据,为以后研究河蚬miRNAs的生物学功能和进化提供了技术。 2.2 材料和方法 2.2.1 河蚬的养殖 河蚬取自洪泽湖,养殖方法见附录1 2.2.2 miRNA的提取与测序 首先使用天根miRcute miRNA提取分离试剂盒对河蚬miRNA进行提取,然后在3’和5’接头加上测序序列,接着进行反转,建库,PCR扩增,使用聚丙烯酰胺凝胶分离纯化145-160nt的小RNA,加接头,最后上机测序。提取与测序流程如图2-1。 图2-1 miRNA库建立与测序 2.2.3 miRNA测序数据生物信息学分析 由Solexa测序产生的单个序列通过FASTX工具进行数据过滤,评估序列质量去除低质量序列和3’接头,5’接头和多A序列,计算小RNA长度分布[143, 144]。余下的干净序列使用blast搜索比对到牡蛎基因组上[145]。接着使用BLASTN将有意义的匹配序列比对到Rfam数据库[17]注释rRNA,tRNA,snRNA和其他ncRNA序列。剩下的小RNA比对到miRBase 21中的后生动物成熟miRNAs库。一样或与参考的成熟miRNAs相关的序列被认为是保守miRNAs。没有匹配到任何数据库的序列被比对到牡蛎基因组用来预测新miRNAs。与牡蛎基因组没有任何差别的序列通过MIPEAP折叠来确定为潜在的新miRNAs。使用了如下法则来确定)用DEPC处理过的水和无水乙醇配制成75%乙醇,按每ml Trizol 液加入至少1ml 的比例加入75% 冰预冷的乙醇,用手轻轻上下翻转约50次,用移液器反复吸吹悬浮的沉淀。 (6)8000 g,4°C下离心5min,尽量弃上清。 (7)室温瞭干,注意不要干燥过分,然后将RNA 溶于无核酸水中。利用DNA 的紫外分光光度计检测提取的RNA样品纯度和浓度。一般OD260/OD280>1.8时,样品纯度符合要求,其余的RNA于-80℃冻存,进行反转录合成。 3.2.3.2. 去除 RNA 中的 DNA (1)用 RNase-free DNase 去除样品中DNA污染。 DNaseⅠ消化处理反应体系(20μL) RNA16μL DNaseⅠ2 μL 10×DNaseⅠ Buffer2μL Total volume 20 μL (2涡旋混匀后,37°C 水浴 30min。 (3)加入RQ1 DNase Stop Solution 1μL,混匀,瞬时离心,65°C 反应 10min。 (4)RNA浓度采用紫外分光光度计测定A260/A280 大于1.8,其余的RNA于-80℃冻存,进行反转录合成。 3.2.3.3. cDNA 第一链的合成 首先使用Multiskan GO酶标仪对提取并去除DNA污染的总RNA进行定量,使用Promeg

人来到这个世界上,

只有两件事:生和死。

一件事已经做完了,

另一件你还急什么呢?

是人,都有七情六欲。是心,都有喜怒哀乐,这些再正常不过了。别总抱怨自己活的累,过的辛苦。永远记住:舒坦是留给死人的。

苦,才是生活。累,才是工作。变,才是命运。忍,才是历练。容,才是智慧。静,才是修养。舍,才会得到。做,才会拥有。

人生,活得太清楚,

才是最大的不明白。

有些事,看的很清,却说不清;有些人,了解很深,却猜不透;有些理,很想不通,却行的通。

总想世界纯澈,却事与愿违,总想事情圆满,却不随心愿,总想人心纯粹,却是一厢情愿...

今后:有缘,不推,无缘,不求。来的,欢迎,去的,目送。一切随缘,顺其自然。

人到了一定年龄,

渐渐地悟透了一些东西。

记住,宁可装傻,也不要自作聪明宁可辛苦,也不要贪图享乐。宁可装穷,也不要炫耀财富。宁可吃亏,也不要占小便宜。

宁可平庸,也不要沽名钓誉。宁可自信,也不要盲目悲观宁要健康,也不要功名利禄。宁可勤奋,也不能无所事事。

世上,没有不快乐的人,

只有不肯让自己快乐的心。

现实看淡了,悲伤骨感。人情看淡了,烦恼不填。缘分看淡了,随心聚散。

是非看淡了,计较变浅。成败看淡了,顺心自然。得失看淡了,自在坦然。

这辈子,和谁过,

怎样过,过多久?

有人因为爱情,有人因为物质,

有人因为容貌,有人因为前途。

而当这日子真的要和选择的人一起过了,你才明白:钱够花就好,容貌不吓人就行。

其实真正幸福的标准,无需理由,很简单,只要笑容比眼泪多,你就找对人了。

人这一辈子:

别太真,别太假,

别太痴心,别太傻。

别太精,别太蠢,

别太善良,别太滑。

简简单单做人,无愧于心;本本分分做事,不欺于人。

坦坦荡荡的活着,对得起自己的良心;有情有义的活着,不辜负别人的真心!

一生有多长,也不过三万天;永远有多远,回头看看已走过一半。

走过坎坷,才知平安就好;尝过酸甜,才知平淡就好;历尽兴衰,才知知足就好;费尽思量,才知糊涂最好。

一辈子不长,

用心甘情愿的态度,

过好咱下半辈子的平凡生活。

无论您有多忙,请花1秒钟的时间把它放到你的圈子里!可能您的朋友就需要!谢谢!

28度热能裤,一穿就热七八度,抗寒过冬,到哪都能扛得住。

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