PCR十大常用网站+结果图剖析

PCR作为老生常谈的一种实验技术,对实验新手而言却仍是一个不小的挑战,比如引物的设计、预测脱靶效率、PCR中的疑难杂症等等,其中任何一个问题都会让他们头疼一阵了。而本文推荐的十个常用网站基本囊括了PCR全方位攻略,你想知道的都可以在这里找到答案。

1.Primer3 

网址:http://primer3.sourceforge.net/webif.php

Primer3是一个非常简单却高效的引物设计在线软件。你只需在目标序列中粘贴DNA序列后点击搜索即可。其中,可通过多种方式来对结果进行筛选,包括PCR产物的大小、引物大小、Tm范围和其他参数。同样,还可使用Primer3来设计用于PCR-ELISA的杂交探针和其他基于探针的PCR引物设计。

2.NCBI

网址:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/

NCBI网站的用途远不止于搜索文献和BLAST。在Primer Blast中,可搜索到合适的引物对(该功能类似于Primer3)或者在输入特异性引物序列后,利用Primer Blast来检测其特异性,进而减少非靶向扩增。在全基因组DNA中,如果你想扩增多基因家族中的一个基因,那么对靶基因的引物进行blast会提高PCR反应的特异性。且该方法也可扩增质粒上的靶标,并降低产生非特异性PCR产物的风险。

3.Serial Cloner

如果你需要定期进行PCR和克隆,那么这个软件绝对值得拥有,可下载适用Mac和Windows操作系统的免费软件。一旦你安装了程序并保存了你的DNA和引物序列,就可以运行虚拟PCR,查看限制性位点,进行酶切测试(甚至可以添加你的分子量标记来了解你的琼脂糖凝胶应该如何看待!),执行序列比对等等。Serial Cloner还可用来制作能放在PPT甚至文章中的克隆质粒图谱。

4. Integrated DNA technologies

网址:https://sg.idtdna.com/country.aspx

尽管这不是一个只针对PCR的网站,但是可以在其中找到很多非常有用的工具来帮你操作PCR反应和实时PCR实验。比如,计算引物和扩增子的一般性质或者依据具体需求来设计特异性的寡核苷酸等。值得一提的是,该网站还会提供一些稀释底物方法,以解决实验中琐碎的稀释计算方法。

5.Gene Quantification Page

网址:http://gene-quantification.info/

这个网站是由创建qPCR相对定量Pfaffl法的Michael P.Pfaffl编辑的,对于qPCR实验新人来说,可能是一个很好的资源。在这里,可以找到有关qPCR的所有知识,包括qPCR新的应用方法、定量算法、循环参数、试剂盒、染料等等。除此之外,许多商业和学术机构都在qPCR平台上对他们的产品以及实验方法做了非常详细的概述。

6.Saccharomyces genome database

该网站对酵母的相关研究方法进行了优化,在Analyze这一栏中,点击Design Primers即可针对酵母基因设计PCR引物。同样点击该栏目下的Restriction Mapper可简单快速地分析酵母基因组的酶切位点,为后续构建基因表达载体打下基础。另外,Webcutter也是一个常用于分析基因酶切位点的在线软件。

7.Rest 2009 Real-Time Quantification software 

网址:http://rest.gene-quantification.info/

该软件是由Michael P.Pfaffl和Qiagen共同研发的,是实时PCR(Realtime PCR)原始数据量化的重要资源。要访问该软件,首先需要在Qiagen网站上(https://www.qiagen.com/cn/loginscreen.aspx?ReturnUrl=%2fcn%2ffeedbackform%2fsurveyform%2frest%2f%3fakamai-feo%3doff)创建一个登陆名并选择使用的PCR仪器,该软件会应用数学模型,来预测靶基因和内参基因的PCR效率。

8.LinRegPCR

在从荷兰的学术医疗中心(AMC)免费下载适用于Windows操作系统的版本后,可从扩增曲线的斜率来估算PCR效率。该软件这适用于使用SYBR标记或其他荧光探针的qPCR反应,并且能与所有qPCR仪器的数据兼容。对PCR效率进行可靠的估算可避免多次优化标准曲线,节省qPCR实验操作的大量时间。

9.ResearchGate

网址:https://www.researchgate.net/

该网站有些像研究者们专属的Facebook,方便研究者联系和跟踪同事,上传发表论文同时也可积极参与研究相关主题的讨论。在该网站注册登录后,查看PCR板块就可以询问到与PCR相关的任何问题,最重要的是此网站中对问题的答复都非常迅速,即便你是个完完全全的PCR新手,也能从中获取很多有关PCR操作的建议和讨论。

10.Protocol Online

网址:http://www.protocol-online.org/

这个网址类似于Research gate的Q&A部分,尽管该网站界面看起来有些简单粗糙,但确是一个protocol集中营,可帮助实验菜鸟解决疑难杂症。其中很多内容均是基于用户体验的,且囊括了很多有关实验方面的问题及答案,因而解决问题时应择善从之,符合或最接近自身实验条件的才是最好的实验protocol。

PCR 结果图剖析

辛辛苦苦提完 RNA,逆转录后一个个孔加完引物和模板,最后进行 RT-PCR,你以为这样就可以美滋滋地坐等结果了?等到一幅下面这样的结果图,不知道对于刚接触 RT-PCR 的你来说内心是否是崩溃的?

这是啥?怎么看?

别急,让我慢慢跟你介绍,看完后你就能准确的分析出你的 RT-PCR 结果了。(这里以 7500 软件为例进行介绍)

1. 首先设置好内参和对照组(在 Analysis Settings 处),一般我们在上机前会对应设置好的,如果设置好的话可以直接跳至第 3 点。如果没有设置好的话是需要重新进行设置。

2. 点击进去后,选择对应好的内参和对照组。(在 Relative Quantization Settings 选项下)

3.选择好内参和对照组后,我们首先看看 PCR 跑的有没有问题,在这里大家最常会见到的问题是在样品池出现了三角形符号,如下图:

那么这些三角形代表什么意思?没错,聪明的你应该已经想到是这个孔出现了问题,而三角形中的数字是几则代表了孔中有几个问题。具体又是什么问题呢?我们就要通过 analysis 中的 QC Summery 进行查找。

举个栗子,比如图中的 A9 孔,出现了 2,则表示有 2 个问题,第 1 个问题如上图所示,High standard deviation 高的标准偏差,表示可能是你上样时导致的样品复孔之间差异较大。第二个问题则是下图中,系统认定 A9 孔中的数值偏差较大,属于异常值。

当然,还有比较常见的问题是引物二聚体引起的双重峰,如 A4 孔。

4. 溶解曲线(melt curve):表示随温度升高 DNA 的双螺旋结构降解程度的曲线。总的 DNA 双螺旋结构降解一半的温度称为熔解温度(Tm),不同序列的 DNA,Tm 值不同。DNA 中 G-C 含量越高,Tm 值越高,成正比关系。正如上面提到的,正常的样品孔溶解曲线应该是单峰的,如下图。如果出现了双峰,则要考虑是否引物设计不合理或者引物过量引起溶解曲线出现多峰的情况。

5. 如果前面的几项都没有太大的问题的话。最后我们看看最重要的结果,也就是目的基因的变化情况了。在内参与对照组选择没错的情况下,点击 gene expression 选项,选中你想查看的样品孔的基因表达情况。

好了,这次的 RT-PCR 看图分析就到这里。最后需要注意的是图中的结果还需要输出进行后续的自行运算得出结果。图中的结果只能给出参考。但大致趋势是相同的,如果还有童鞋想听后续如何计算 RT-PCR 的结果及原理的话,欢迎关注下期的 RT-PCR 结果的计算原理与计算模板。

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  • 原文链接:http://kuaibao.qq.com/s/20180129B1BYXZ00?refer=cp_1026
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