想从头研究ceRNA的调控网络,需要如何制定测序方案?

嘿,答疑呀嘿时间到!

今天又是每周的问题解答时间,首先感谢提出问题的小伙伴,你们的问题也帮助其他小伙伴学习了更多;接下来感谢本周的答疑老师:其明实验室的孔老师、生信部的谢老师!

话不多说,来看一下本周大家都问了什么问题

Q1-qPCR

问:怎样才能知道自己合成的引物特异性好不好呢?

答:做个预实验,看下熔解曲线(是熔解曲线,不是溶解曲线哦)。看看是不是单峰,然后看看熔解温度,一般大多引物会在80度以上,当然要参照NTC的熔解温度一起看,一般NTC的熔解温度会比实验样本低很多或者NTC直接表现为没有峰。

Q2-qPCR

问:接问题1,NTC是什么?

答:NTC:no template control,没有加模板的对照,或者称作阴性对照。

Q3-qPCR

问:熔解曲线如果有峰,但是很宽大,并且加cDNA和加水是一个峰,这怎么解释呢?

答:峰宽则为引物不特异,水和模板一个峰,那就是引物二聚体或者体系污染。出现引物二聚体的解决办法就是重新设计引物。

Q4-生信分析

问:GO analysis和GSEA两种分析方式的区别是什么?

答:GO analysis和GSEA都是基于Gene ontology数据库进行的富集分析,GSEA中也可以选用其他的数据库进行分析,其次GSEA要求提供每个基因的表达值,所以结果中可以提供每个功能中包含的基因的聚类图和富集图。

Q5-全外显子组测序

问:外显子测序为何强调“有效测序深度”,与“测序深度”的概念有何区别?

答:首先明确两个概念:

测序深度:测序得到的总碱基数与目标区域大小的比值。捕获效率:比对到参考基因组中目标区域的数据量占比对到参考基因组上总数据量的比例。

例如:若使用Agilent Sureselect Exome Kit V5,试剂盒的捕获范围为50M,测序得到500M数据量时,测序深度为500/50=10×;但是由于外显子试剂盒会有捕获效率,大约在60%以上,所以实际上目标区域数据量只有500M*60%=300M,目标区域测序深度 300M/50M=6×,称为target depth。

Q6-生信分析

问:FDR不是越大结果越可靠吗(接上周答疑:答疑呀嘿丨P值、FDR、Q值有偏差,会对发文章有影响吗?!中的问题6)

答:P值即概率,反映某一事件发生的可能性大小。统计学根据显著性检验方法所得到的P 值,一般以P

Q7-转录组测序

问:转录组测序都能做哪些分析,有哪些个性化的分析内容?

答:转录组测序包括mRNA测序,lncRNA测序,circRNA测序和miRNA测序;以上测序除了可以对基因/转录本表达定量、筛选差异表达基因、功能通路富集分析外,mRNA和lncRNA测序还可以进行转录本层面分析,可变剪切分析,新转录本预测等。以上转录组测序可以联合进行ceRNA分析。

Q8-课题讨论

问:在没有明确目的的情况下如何挑选基因进行后续研究?

答:

可以挑选P值和Q值低且差异倍数大的基因;

可以挑选网络图中核心的基因;

还可以根据课题的研究背景和研究目的挑选基因;

根据KEGG、GO富集结果,选取有代表性的差异基因进行实时荧光定量 PCR(qRT-PCR)验证 。

Q9-生信分析

问:数据为什么要做标准化?

答:对数据标准化的目的是消除特征之间的差异性。使各次/组测量或各种实验条件下的测量可以相互比较,消除测量间的非实验差异。非实验差异可能来源于样品制备、杂交过程或杂交信号处理等。

Q10-测序方案

问:想从头研究ceRNA的调控网络,需要如何制定测序方案?

答:一般如果想深入研究整个ceRNA网络的话,需要mRNA、lncRNA、circRNA、miRNA测序的数据。因此相应的测序方案可以选择全转录组测序(只去掉核糖体RNA,解析mRNA+lncRNA+circRNA)+ miRNA-Seq, 或者也可以选择全转录组测序(只去掉核糖体RNA,只解析mRNA+lncRNA)+ circRNA-Seq(加入RNase R 去掉线性RNA)+ miRNA-Seq 的方案。

以上就是本周大家提出的问题了

你呢?

你还有哪些问题?

欢迎在下方或者后台留言提问哦~

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