评估肿瘤纯度的方法（二）：基于单核苷酸变异 TPES

导语

GUIDE ╲

对肿瘤样本进行基因组和分子分析时，首先需要定量肿瘤和混合的正常细胞的比例[肿瘤纯度(TP)或肿瘤细胞性]，用以评估体细胞损伤检测边界并进行适当的比较分析。接下来我们会介绍一些评估样本纯度的方法。之前我们有介绍基于甲基化评估肿瘤纯度的R包InfiniumPurify。

背景介绍

基于体细胞拷贝数变异（SCNAs）来评估肿瘤纯度的方法有ABSOLUTE (Carter et al.,2012)、ASCAT (Van Looet al.,2010)、Sequenza (Favero et al.,2015)和CLONET (Prandi et al.,2014)；基于转录组数据评估TP的方法有ESTIMATE (Yoshihara et al., 2013)；基于甲基化数据评估TP的方法有LUMP (Aran et al., 2015)和PAMES(Benelli et al., 2018)；基于突变评估TP的方法有 PurityEst (Su et al., 2012)。TCGA支持使用基于SCNAs的工具来评估TP，而对于甲状腺癌(THCA)和肾脏肾透明细胞癌(KIRC)，其基因组是‘quiet’（可识别的SCNAs是非异常的），所以这种基于SCNAs的TP评估方法是不适用的。

估计肿瘤纯度的方法TPES，是根据体细胞单核苷酸变异(SNVs)的可变等位基因片段(VAFs)在拷贝数中性的肿瘤片段中的分布来估计DNA纯度。

TPES方法

纯的肿瘤样本的变异等位基因分数（VAF）分布应该是0.5，（例如观察肿瘤细胞，如果所有的细胞都含有相同的异质突变，那么肿瘤细胞纯度为100%，变异等位基因分数是50%，即每个染色体的一半）。一些技术手段和癌型特异因素会影响VAF值，并且例如，如果SNV在拷贝数为3的区域出现，其VAF是只会在1/3，2/3或1左右波动。

认为二倍体片段内的克隆单等位SNV适合于TP评估，命名为p-SNV。通过使用保守的方法选择合适的p-SNV，用来评估TP，确定用来评估纯度值所需的最小SNV数量。为了最大程度减少每个样本的假阳性p-SNV数量，TPES使用两个主要的过滤步骤。

TPES的第一个过滤步骤：

(i)通过对每个基因组片段的log2R值（肿瘤与正常细胞覆盖率进行log2转化），进行保守筛选，如[-0.1，0.1]，来识别拷贝数中性片段中SNVs。

(ii)通过染色体倍性(TPES输入参数为连续值)来调整log2R分布，解释非整倍性基因组。

(iii)通过保留那些分别在定义的阈值之上和之下的替代碱基和AF的读取次数（默认设置为5和0.55），来选择假定杂合SNVs。

TPES的第二个过滤步骤：

为了避免性别分层，将X和Y染色体从分析中排除。首先指定一组杂合的拷贝数中性SNVs，即cnn-SNVs，cnn-SNVs是SNVs的子集。在第二个过滤步骤中，TPES从设置的cnn-SNV中删除假定的亚克隆突变。通过使用一定范围的带宽值的核密度评估（KDE）使观测cnn-SNVs的VAF分布平滑化。

该方法用于TCGA数据集，获得不同肿瘤类型的p-SNVs。为了系统地评估能够可靠地估计TP的最小数量的p-SNVs，将TPES与基于SCNA的评估方法进行了比较。图A显示，> 9个p-SNVs与CLONET估计值具有很大的相关性；ABSOLUTE和ASCAT观察到了类似的趋势。

通过对TCGA的30个癌型的7809个样本用TPES和其余7种方法进行评估，用斯皮尔曼相关评估结果，CLONET 与 TPES有高的一致性（图A,B）。

R包应用

01

TPES_purity计算样本纯度

例：TCGA_A8_A0A7

(1)使用数据：

TCGA_A8_A0A7_seg:

TCGA_A8_A0A7样本的SEG文件，为数据框。

TCGA_A8_A0A7_maf：

TCGA_A8_A0A7样本的体细胞SNVs计数数据，为数据框，包含SNV的染色体，SNV的位置，参考和替代碱基count，以及样品ID。

TCGA_A8_A0A7_ploidy:

TCGA_A8_A0A7样本的染色体倍性数据，数据框。

(2)计算纯度:

TPES_purity(ID= "TCGA-A8-A0A7", SEGfile = TCGA_A8_A0A7_seg,
            SNVsReadCountsFile =TCGA_A8_A0A7_maf, ploidy = TCGA_A8_A0A7_ploidy,
            RMB = 0.47, maxAF= 0.55, minCov = 10, minAltReads = 5, minSNVs = 10)

参数解释：

#RMB：

参考匹配偏差（Reference Mapping Bias）值。参考基因组在任何给定的位点上只包含一个等位基因，因此携带非参考等位基因的读序列在比对时不太可能被匹配到；导致了从0.5的偏移，它可以用1−medAF评估，其中medAF是样本的种系杂合SNPs等位分数（AF）的中位数。默认值为0.47。

#maxAF：

对SNVs等位基因分数(AF)分布的滤波。这个对于确保只保留杂合SNVs是必要的。无性系和亚无性系SNVs，其AF大于maxAF，将会被去除。

#minCov:

保留SNV的最小覆盖范围

#minAltReads:

保留的SNV的替代碱基的最小覆盖范围

#minSNVs:

评估纯度所需的最小SNV数量

(3)输出结果:

TPES_purity:

sample：样本ID

purity：TPES评估的样本纯度

purity.min：TPES评估样本的最小纯度

purity.max：TPES评估样本的最大纯度

n.segs：TPES使用的中性片段的拷贝数

n.SNVs：TPES使用的SNVs数

RMB：用来评估纯度的参考匹配偏差值

BandWidth：TPES选择的密度函数的平滑带宽值

log：报告运行是否成功，否则提供调试信息

02

TPES_report计算纯度、生成图形报告

TPES_report函数生成关于TPES_purity使用的假定克隆SNVs的等位基因分数值和TPES_purity计算的密度函数的图形报告。

例：TCGA_A8_A0A7

TPES_report(ID= "TCGA-A8-A0A7", SEGfile = TCGA_A8_A0A7_seg,
            SNVsReadCountsFile =TCGA_A8_A0A7_maf, ploidy = TCGA_A8_A0A7_ploidy,
            RMB = 0.47, maxAF = 0.55, minCov =10, minAltReads = 5, minSNVs = 10)

输出图形：

柱状图表示了推测的克隆和亚克隆SNVs在拷贝数中性片段和TPES检测到的峰值的等位分数分布。密度图表示密度函数如何根据不同的带宽值变化；只考虑导致最多两个峰值的带宽值。

小编总结

TPES方法是通过计算体细胞单核苷酸变异(SNVs)的可变等位基因片段(VAFs)的分布来评估DNA的纯度，它的优势是计算拷贝数为中性的肿瘤纯度，比如SCNAs非异常的甲状腺癌(THCA)和肾脏肾透明细胞癌(KIRC)。同时TPES方法与其他评估肿瘤纯度的方法有很高的一致性。

引用：

Locallo A, Prandi D, Fedrizzi T, Demichelis F. TPES: tumor purity estimation from SNVs. Bioinformatics. 2019;35(21):4433–4435. doi:10.1093/bioinformatics/btz406

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