临床样本组学研究Day6 : 临床样本的单细胞转录组测序

近十余年来，高通量测序技术被广泛应用于生物和医学的各种领域，极大促进了相关的研究和应用。其中转录组测序（RNA-seq）被广泛应用于测定和描绘各类物种的基因或转录本的表达情况。

传统的转录组测序技术（bulk RNA-seq）是基于群体细胞，每个样本包含成千上万个细胞，所以最终反映的是基因在群体细胞中平均表达水平，从而掩盖了不同细胞之间的表达异质性。当你还在沉迷于普通转录组数据挖掘时，已经有人悄悄的搞上单细胞了。今天我们就来聊聊基于临床样本的单细胞转录组测序。

简介

定义：单细胞转录组测序（single-cell RNA-seq，scRNA-seq），顾名思义就是在单个细胞的分辨率基础上去研究细胞内的基因表达等，是在单个细胞水对mRNA 进行高通量测序的一项新技术。

目的：针对单个细胞研究其整体水平的基因表达情况，成功解决细胞分子机制研究中常见的细胞异质性、细胞量少而无法进行常规高通量测序等难题。

实验技术流程

在单细胞转录组前期，主要依赖三种方法：SMART-seq2技术、Andeplete技术以及10×genomics单细胞转录组测序技术，今天主要跟大家详细介绍一下第三种。

单细胞转录组测序技术流程图

实验技术流程：

（1）逆转录：凝胶珠进入第一个进样口与细胞悬液和酶等混合，通过第二个进样口时被油滴包裹，形成GEMs（有效GEMs中包含胶珠（胶珠中有预制的10x引物）、单细胞、和Master Mix。），随后细胞裂解，凝胶珠溶解，进行逆转录；然后，在GEMs内进行细胞裂解和逆转录反应。有效GEMs中，10X Barcode将与cDNA产物连接在一起，接下来再将GEMs破碎并打碎油滴，以cDNA为模板进行PCR扩增，cDNA扩增完成以后，针对扩增产物进行质检（扩增片段大小以及扩增产物的产量）。

（2）测序文库构建：首先利用化学方法将cDNA打断成200-300bp 左右的片段，cDNA片段化、末端修复和加A，进行cDNA片段筛选，P7 Adaptor接头连接并通过PCR扩增引入样品Index，最后进行片段筛选从而得到cDNA文库。

（3）高通量测序：库检合格以后，利用Illumina测序平台进行测序，获得测序数据；

（4）进行数据分析。

案例分享

1、细胞分群以及定义

单细胞转录组测序文章的第一张图往往是一张降维图（t-SNE），用以说明该研究一共测了多少个单细胞，然后根据其转录组特征对这些单细胞进行分群，然后再根据每个细胞亚群中特异性高表达的基因进行定义。

数据呈现：（图b）：就是细胞分群以及定义，这是整个文章研究的基础，后续的深入分析和探究都是基于此进行的。（图C）：是指每个发育阶段中这些细胞亚群的变化趋势，通常反映的是不同状态下细胞亚群的变化，而那些具有显著变化的亚群通常是后续研究的重点。

2.基于不同细胞分群的功能表型差异分析

在单细胞转录组测序及分析中，我们说细胞分群是根据每个亚群特征性高表达的基因去定义的，这也就是驱使我们去计算每个细胞亚群的差异基因，用来代表哪些基因在哪些亚群中特异高表达。

数据呈现：（图G）PLAU、CHI3LI等基因在肠道Inflammatory fibroblasts细胞中高表达，而这些基因又是结肠炎疾病和纤维化相关基因、CAF相关基因。说明该研究发现的Inflammatory fibroblasts细胞分群可能就是在该疾病进展过程中具有病理意义的细胞。

3.拟时间序列分析

什么是拟时序分析？

• 拟时序分析，即根据不同细胞亚群基因表达量随时间的变化情况，构建细胞谱系发育，但这里的时间并不是真时间，而是一个虚拟的时间，是指的细胞与细胞之间的转化和演替的顺序和轨迹。
• 即使在同一个样本中，也会存在多种不同的细胞形态。因此，不论测定了多少样本，我们都可以采用拟时序分析对样本中的细胞转化和变化进行描述。

为什么要进行拟时序分析？

• 机体为响应各种应激，其细胞会从一种功能“状态”转变为另一种功能“状态”；
• 当细胞在不同状态之间转变时，往往会经历转录重组，导致一些基因被沉默，一些基因被重新激活，但纯化这些瞬态细胞进行研究是很困难或不可能的；
• ScRNA-Seq拟时序分析可以在不需要纯化的情况下查看这些细胞状态。

数据呈现：（图 h） 就是对细胞进行了拟时序分析，箭头表示分化发育的方向，然后根据这种发育方向，发生显著变化的基因共有四种模式（图 i），比如 Pattern4 是随着分化发育逐渐上调的基因，而 Pattern2 则是随着分化发育逐渐下调的基因，（图 j） 选择了每个 Pattern 的四个代表性基因进行展示。

4.细胞互作分析

这是单细胞转录组分析中另一重要部分，也是目前逐渐兴起和被广发应用的，尤其是在免疫细胞群体之间。

细胞互作分析是基于受配体对进行的，它要求：①受体、配体要在某种细胞中特异性表达（上图：配体CXCL12和受体CXCR4，是在Follicular细胞中特异性表达）；②受体和配体的表达有关联性；③进行和疾病相关细胞的互作分析时，这些细胞一定是在病变组织中的比例是比较高的。满足以上3点我们就可以理解为某两种细胞通过某受体-配体进行相互作用，存在互作关系，可能存在某种病理学意义。

小结

1．单细胞转录组测序技术是一种高分辨的在单细胞水平对某一确定的细胞群体转录组的异质性进行分析，其最大的优势在于研究细胞的异质性，以及探索传统bulk测序不能发现的细胞新表型和新功能；

2．构建组织细胞全转录组图谱的单细胞转录组研究已经比较泛滥，下一步需要对多种研究靶细胞进行深入挖掘，从而发现新型功能细胞亚群。在组织中分选特定细胞，组织样本的处理和细胞分选技术非常重要（技术注意事项可以多向测序公司咨询）；

3．对于利用临床样本纯单细胞测序研究来说，要重视单细胞测序数据分析算法的个性化，利用各种不同巧妙的算法尽可能多挖掘测序数据中隐藏的信息，一般需要专业生信团队的协作配合。