敢答 | 单细胞生物学路在何方？

编者按：单细胞技术路在何方？单细胞生物学有着怎样的前景？单细胞技术将怎样有益于人类健康？随着技术的发展和普及，所有关心单细胞技术发展的人们不仅关心以上问题的答案，在很多个掩卷沉思中，都在孜孜不倦地探索它们。“不因渔父引，怎得见波涛？”本文采访了几个单细胞领域内经常活跃的科学家，涉及单细胞多组学、细胞自组织、数据整合、深度学习、单细胞分析标准化等话题。译者水平有限，不免由于理解不足而频生错讹，原文链接在文末，荐读。"见之不若知之，知之不若行之"。单细胞生物学的未来就在你我每一次求索之中。跟着运来兄搭建自己的生物信息小书房。趁年轻，读几本硬书，到老了慢慢反刍。

"喜看稻菽千重浪，遍地英雄下夕烟"。快速发展的单细胞生物学(Single-cell ，为我们理解细胞类型、细胞状态、细胞间相互作用和组织结构提供了单细胞水平视野。单细胞分析适于解析细胞异质性较高的的动态生物学过程，如细胞命运决定、组织模式和发育轨迹推断。除了这些生理背景外，单细胞方法也被广泛应用于疾病研究，癌症和传染病。了解疾病背景下的细胞异质性具有重要的临床应用，包括开发改进的诊断工具和靶向治疗方法。此外，单细胞生物学使细胞重编程与合成生物学结合成为可能。

一如不断发表的单细胞研究文章中所描述的，尽管单细胞分析做出了许多值得注意的贡献，但仍有几个问题有待解决。

• 各种已识别的细胞类型/细胞状态的功能(function )是什么?
• 还有多少种细胞类型和或细胞状态有待识别?
• 它们如何与动植物体内潜在动态过程联系起来?
• 我们如何理解(自下而上的)自组织细胞行为与微环境在给定的生理环境中的相互作用?
• 我们如何从单细胞数据中推断出细胞间相互作用的规则和特性，从而更好地理解组织器官是如何组织起来的(tissue organization)?
• 什么样的计算方法能够整合多种数据模式，并不断利用公开的大量数据进行新的生物学发现?
• 将单细胞多组学方法与显微镜、成像和深度学习领域的未来发展相结合，可以研究哪些新问题?

随着新技术不断突破原有认知边界，新的细胞类型和调控关系不断涌现，新的问题和机会也随之而来。

文中，单细胞领域内科学家们讨论了单细胞生物学新的突破、当前的挑战和新出现的机会，并分享了他们对“该领域的发展方向”的看法。他们每个人都根据自己的研究重点给出了不同的观点，为单细胞生物学的未来提供了一个综合的观点。我们很高兴分享这篇文章，并希望它能激发更加广泛的思考与讨论。

正如生物教科书中经典的断语所讲：细胞是生命的基本单位。虽然细胞生物学是一个成熟的领域，但最近的单细胞技术大大提高了我们获得各种细胞中基因表达谱信息的能力，包括转录本、蛋白质、代谢物和生物分子结构。数据通量的激增为理解生命系统、处理疾病条件甚至设计合成细胞提供了前所未有的机会。

在发育过程中，单个细胞相互作用产生了复杂的多细胞生物。尽管有机体中所有的细胞都含有相同的遗传物质，但它们分化成不同的细胞类型————不同的细胞状态、获得独特的形状、执行不同的生理功能。研究不同细胞属性(如空间组织、迁移特性、物理连接、分化谱系、超微结构)之间的相互作用，以及这些因素在各种生理和病理背景下如何促进或破坏内稳态，是理解多细胞系统的关键。探索这些问题可能需要整合多种技术，包括冷冻电子断层扫描、单细胞空间、基因组和蛋白质组学方法、大规模遗传扰动方法以及成像技术(如组织透明和扩增显微镜)。除了多细胞生物，单细胞水平的研究非常适合理解物种多样性和不同生态环境下不同生物之间的相互作用。例如，在涉及微生物、病原体及其与宿主细胞及其环境的相互作用的系统中，单细胞分析可以揭示分子决定因素(如毒素-抗毒素系统)，以及控制相互作用和涌现特性的原则(如协作、竞争、持久性和细胞群动态)。

不断增加的单细胞数据的财富和计算方法(如深度学习技术、迁移学习和大型语言模型)的突破性有望将使目前不易整理的大规模数据集实现标准化。这将允许跨物种的比较研究，对生物适应不同环境提供细胞分子见解。识别用于研究生理和疾病现象的系统，并将促进相关模式生物的药物发现。在疾病的背景下，这些进展为理解自然基因组变异的影响、发现病理性突变位点以及开发治疗方法提供了巨大的潜力。这些新见解将推动细胞重编程、细胞疗法、生物合成材料以及特定生态位内的微尺度生态系统工程的进步，从而使我们能够设计合成细胞系统,用于医学和生物技术应用。

为了实现以上畅想，必须为下一代单细胞科学家提供正确的教育、培训、科学资源与资助，使他们能够大胆地追求这些具有挑战性的问题。接受细胞生态的系统观点，这些细胞与环境和彼此相互作用，将为理解生命、治疗人类疾病和保护我们的生态系统提供一个全新的概念框架。

发育是一系列时空协调的过程，单个细胞分化为不同的细胞类型，并建立组织尺度的结构和功能。在整个生命过程中，持续的组织更新也需要细胞间的精细时空协调。细胞间的相互作用如何产生特定的环境和时空协调是生物学中的一个关键问题。一个主要的概念和技术问题是:了解分子和物理机制，使组织中的细胞感知复杂的环境，并作出个体协调的决定。该领域正在通过改进所有单细胞测量方法(从转录物和蛋白质到脂质)来回答这些问题。然而，这些多组学单细胞数据的整合，特别是当它们跨越生物学尺度时，需要更多的自组织(self-organization)概念。

关键的挑战是，发育和再生过程依赖于细胞群的内在自我组织，而组织不是自上而下构建的机器，而是自下而上地由通过短期和长期细胞相互作用来建的。这些相互作用在本质上不仅是化学的，还是机械的和电子的(mechanical and electrical )。因此，单个细胞需要有内部感知机制来知道它们在"哪里"以及“何时”，来协调它们在空间和时间上的行为，以控制器官大小和组织稳态等关键过程。

我们现在正处于一个激动人心的时代，可以在高度可及的体外模型系统(如类器官)中，在机械控制和工程设计的微环境中集成单细胞，以了解单细胞如何具有内在能力，并自组织为多细胞的有机系统。

单细胞基因组学领域为不同的生物系统提供了开创性的见解，并确定了在各种生理过程和病理中发挥主要作用的新的细胞类型及其分子途径。在实验技术和数据分析双重突破的推动下，单细胞技术不断发展，例如最近将单细胞和全基因组分辨率的CRISPR筛选结合，将RNA分析与蛋白质组学、代谢组学、表观遗传数据和细胞-细胞信号传导相结合。预计推动该领域向前发展的主要是单细胞空间技术的进步，将单细胞数据转化为更好地理解细胞-细胞相互作用，以及不同细胞和细胞类型如何在人体中创建不同的生物壁龛(biological niches )，以及将时间维度纳入单细胞生物学。此外，将临床数据与单细胞多组学分析相结合有望为许多病理的潜在生物学提供新的见解。

然而，增加更多的数据也给该领域带来了挑战。整合各种类型的数据需要新的计算工具和方法，这是单细胞研究迈向下一个水平的主要障碍之一。这些新型计算工具能够更快地将单细胞技术纳入临床，而目前这一过程受到解读单细胞数据所需分析的复杂性的阻碍。使用这些额外的单细胞信息层和分析方法也可以为免疫系统和组织细胞之间的相互作用如何参与各种病理状况的出现提供新的线索。这一理解可以帮助我们识别驱动这些病理的信号，并开发新的突破性疗法，这些疗法基于对当前疗法及其弱点的准确建模和理解。

我们的愿景是，单细胞分析将越来越多地同时涵盖不同的数据模式，不仅关注分子谱分析，而且关注表型特征。在这方面，目前的单细胞组学分析的一个主要局限是它们通常需要破坏单细胞实验中的细胞，从而阻碍了对同一细胞的下游分子或功能分析。为了解决这一问题，我们开发了Live-seq，这是一种从单细胞采样到细胞质活检，然后通过超敏感的RNA-seq方案进行处理的方法。Live-seq提供了单细胞的无偏倚基因表达谱，同时保持细胞存活和功能，为研究一系列生物学过程(包括干细胞分化、感染、疾病进展和耐药性)打开了令人兴奋的机会。Live-seq不仅可以直接测量基因表达变化以揭示单细胞的分化轨迹，还可以在功能分析之前记录细胞的分子历史。这为研究细胞状态动力学提供了新的手段，也为研究细胞在受到相同的内源性或外源性刺激时产生不同反应的原因提供了新的途径。

此外，由于不需要进行细胞分离，Live-seq可以根据其相对空间位置对单个细胞进行靶向测量。这为研究细胞与细胞之间的相互作用提供了一种新的方法，例如研究非感染的旁观者细胞在感染时的反应，或近端龛细胞的干细胞信号转导。虽然Live-seq的许多应用已经可以实现，但未来对其的改进将包括实现采样过程的自动化和多路复用，以提高通量，提高RNA-seq的灵敏度，并进行多组学分析。提高通量对于提供统计稳健性和探索稀有细胞的潜力至关重要。提高RNA-seq的灵敏度将提高总体效率，并允许每次分析时使用较小体积的活检，从而有可能测量单细胞图谱的重复，或对同一细胞进行多重组学分析，因为细胞质活检不仅包含转录本，而且还包含蛋白质和代谢物。我们预计，灵敏度的提高也将极大地有利于其他活细胞采样方法，如玻璃纳米滴管和纳米吸管。后者已被用于收集用于分子分析的单细胞活检，并有可能进一步普及活细胞组学分析和表型分型。

单细胞生物学领域正在迅速发展，并对生物学和生物医学研究产生了广泛的影响。单细胞研究通常采用两种主要方法，一种方法侧重于使用生物传感器和活细胞对特定刺激做出反应时的成像来测量一个或几个信号分子的动力学，并将它们与表型结局联系起来。这种方法最近的例子包括研究p53、NFkB和磷酸化的动态变化，并将其动态变化的特定特征与其靶基因的表达和细胞行为(如增殖、细胞死亡和分化)联系起来。第二种方法专注于在大量固定的单细胞中测量分子水平信息。这种方法最近的例子包括单细胞RNA-seq测量，以绘制早期胚胎发育期间的基因表达变化，并揭示T细胞对感染反应的异质性。我们需要一个能够长时间集成这两种方法的健壮的高通量平台。将活细胞内信号分子的实时测量与单细胞组学连接起来，对于开发强大的预测模型至关重要，这些模型可以预测生物学如何工作、疾病如何出现以及单细胞治疗的结局。将单细胞组学数据和细胞结局联系起来也很有希望识别新的疾病生物标志物。

实体组织通常由重复的解剖结构组成，如肠绒毛、肝小叶和肾。这些结构由于血流或形态发生而极化。因此，细胞感知独特的微环境，这些微环境中氧气、营养物质、微生物含量和其他因素的水平取决于它们在结构中的位置。作为进化适应，组织将不同的任务分配给不同区域的细胞，这种现象被称为“分区”(zonation)。单细胞技术为我们理解跨组织的分区模式做出了巨大贡献。通过将组织分离并测量成千上万个细胞的完整转录组，我们获得了全面的分区图，同时对代表性“标志性基因”的空间表达模式进行定量绘制，从而推断分离细胞的起源区域。空间转录组学进一步促进了基因整体空间表达模式的原位重建。在组织生物学中，一个突出的挑战是重建细长细胞(如成纤维细胞、内皮细胞和神经元)的空间表达模式，这些细胞通常表现出胞内RNA极化。一个例子是肠端细胞，这是一种长度可跨越数百微米的龛位细胞，它将不同的mRNA分子定位到细胞内不同的坐标。这种将mRNA定位于数百微米以上的不同细胞区室的能力，打破了我们对细胞作为组织基本构建模块的基本定义。空间转录组学技术不断提高的通量和空间分辨率可以揭示这些具有挑战性的细胞类型的空间表达程序。

单细胞蛋白质组学(scProteomics)是继scRNA-seq之后的新兴技术，它彻底改变了我们对细胞类型和细胞-细胞异质性的理解。蛋白质组学的发展得益于样品制备方法、质谱仪、扫描模式和数据处理算法的进步。它们一起使每个细胞识别和定量成千上万种蛋白质成为可能。与主要在分离的细胞上进行的类似scRNA-seq的重复分析不同，我们的团队提出在AI引导下激光显微切割后，直接从固定的组织中分析单细胞或细胞类型。这种“深度视觉蛋白质组学”为蛋白质组学结果提供了丰富的空间背景，并捕获了生物学变异性，同时平均出具有相同功能属性的人群中的随机变异性。

在未来的几年中，蛋白质组学有望在灵敏度、通量和空间分辨率方面继续进步。读出生物异质性的功能效应的能力将为单个细胞的生物学提供新的见解。蛋白质组学可能在癌症诊断中变得特别有价值，它可以揭示细胞异质性和干细胞壁龛的功能作用。深度视觉蛋白质组学特别适合这项任务，因为它可以发现隐藏在批量数据中有生物学意义的差异，并可以绕过当前单细胞蛋白质组学的一些技术限制，如通量和覆盖深度。显然，蛋白质组学是理解细胞生物学的有力工具，有可能彻底改变我们在单细胞水平上对疾病的理解。

单细胞和空间解析的多组学技术使我们能够“看到”多细胞系统的基本原理，而这是批量(Bulk)技术无法实现的。不同组学层的结合提供了细胞中不同分子过程的互补信息。我们预计，这些数据模式以及相应的统计和机器学习方法将有助于研究组织和器官中细胞的协调功能。具体而言，当在大型患者队列中使用时，这些策略将告诉我们组织结构的变异性，从而了解驱动疾病表型的失调多细胞程序。

当单细胞技术与扰动实验相结合时，将使我们能够更多地了解细胞表型中的因果关系。为此，我们认为机器学习必须得到我们对潜在分子机制的先验知识的支持。这些见解还可以作为动态机制模型的基础，这些模型最终将允许我们模拟药物或组织中的其他扰动的效应。所有这些进展将最终改善疾病进展的预后和患者的治疗。

单细胞生物学首先出现在显微镜下，并经过了长足的发展。在通量和多组学方面，规模已经急剧扩大。因此，现代数据科学方法成为分析大数据集的关键也就不足为奇了，而机器学习和人工智能(AI)是其中关键的驱动方法，例如，识别细胞状态和细胞类型，学习单细胞动力学或跨条件、扰动和规模整合数据。人工智能的下一个趋势是大型语言模型，或更一般地称为基础模型，定义为在大量数据集上以无监督的方式训练的大型生成神经网络，从而使许多下游应用程序以并行模式跨任务学习。我期待看到这些想法被普遍应用于人工智能，特别是单细胞生物学。

单细胞生物学领域一直由无监督机器学习方法主导，从早期的聚类和拟时序方法到数据整合或扰动模型。最近，与十年前计算机视觉领域发生的情况类似，深度学习已开始在足够复杂的任务中超越经典的机器学习。下一步将是不仅在模态、扰动、器官甚至物种内整合样本，而是旨在学习所有可用协变量之间的细胞变异。由此产生的深度嵌入将形成细胞基础模型的早期版本，不仅将以生成的方式连接分子，而且将空间和形态的模式。一旦这些模型变得健壮和更广泛可用，我们现在用单独的算法处理的许多问题就可以使用这个基础模型来解决。该模型将能够快速地将新样本置于背景中，或预测看不见的扰动的影响，并使这些扰动朝着期望的状态(例如，在特定疾病状态的情况下)设计成为可能。类似地，一旦细胞嵌入到一个联合的潜在空间或模型中，就可以有效地进行跨器官的比较，例如在一个免疫细胞图谱中进行比较。发育或进化问题可以通过在这样一个整合模型中观察细胞状态随时间或物种的变化来解决。

由于现代语言模型能够生成文本作为查询的答案，我们将能够查询细胞基础模型，了解健康和疾病中看不见的新细胞状态。

相对年轻的单细胞生物学领域发展迅速。虽然标准3 ' mRNA测序已在生物医学的所有领域变得普遍，但单细胞生物学现在正变得越来越多模态和多尺度。这对分析日益复杂的数据集提出了重大挑战。整合多模态数据以及分析和解释空间单细胞测序数据并不是一项简单的任务。用于数据集成和分析的计算流程没有标准化，而且各个实验室之间的计算方法差异很大，因此即使在同一生物医学领域内，也很难比较结果。

例如人类细胞图谱倡议，正在努力建立数据分析和解释的标准化程序。我们迫切需要标准化的细胞类型标签，但目前尚不清楚如何才能最好地实现这一目标。此外，分析流程和细胞标签随时间变化，需要对分析过程的工具进行版本控制。在这些问题上达成共识将对该领域产生重大影响，并将有助于推动单细胞生物学进入下一个水平。

单细胞生物学在生命科学中有许多令人兴奋的应用。例如，了解肿瘤在不同微环境中的复杂空间组织和调节过程，结合使用T细胞受体测序等技术的免疫细胞表型分型，肯定会对癌症诊断和全新疗法的设计产生影响。从长远来看，基于多尺度、多模态单细胞测序对疾病发生和进展的深入了解将有助于有效治疗甚至治愈目前预后非常差的疾病。

[Single-cell biology: what does the future hold?](https://www.embopress.org/doi/full/10.15252/msb.202311799)