动物行为与光电专题（36）丨动物不同刺激范式下钙信号记录

奖赏刺激范式：‍

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无条件奖赏小鼠在头部固定系统中适应2-3天，并且在实验开始前一天禁水24小时。在实验期间，将小鼠头部固定，并且直接往小鼠口腔内输送5%蔗糖水作为奖赏。小鼠共接受30次奖赏刺激，每次刺激之间采用随机时间间隔(25-40s的范围内)。

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条件化奖赏适应阶段：将小鼠放置在头部固定系统，并给其随机呈现5次中性的声音刺激(5s，10kHz，正弦波，80dB)；

条件化阶段：给小鼠随机中性声音刺激(与适应阶段相同)，并在声音刺激结束前1s，给予小鼠1s的糖水奖励。该刺激重复30次，刺激之间采用随机时间间隔(60-120s之间)；

记忆测试阶段：在条件化24小时后，给小鼠呈现30次CS刺激，此时刺激的不给任何糖水奖励。

厌恶刺激范式：

将小鼠置于不透明的树脂玻璃箱内(25cm×25cm×70cm；长×宽×高)中，箱底铺有金属网格底板用于足部电刺激(0.6mA，0.5s)。

在无条件的厌恶刺激期间，给小鼠足底0.5s0.6mA的电流刺激，该刺激重复5次，每次刺激间采用随机时间间隔(间隔60s-120s；

条件化奖赏适应阶段：将小鼠放入电刺激箱内，并给其随机呈现5次中性的声音刺激(5s，3kHz，正弦波，90dB)；

条件化阶段：给小鼠随机中性声音刺激(与适应阶段相同)，并在声音刺激结束前0.5s，给予小鼠0.5s0.6mA的电流刺激。该刺激采用随机时间间隔重复5次(60-120s之间)；

记忆测试阶段：在条件化24小时后，给小鼠随机呈现5次CS刺激。

研究了VTAVGluT2+神经元是否对本能的厌恶刺激有反应。为此，我们首先在VGluT2-cre转基因小鼠的VTA脑区中注射AAV2/9-EF1a-DIO-GCaMP6s病毒，把钙成像指示剂蛋白GCaMP表达在VTAVGluT2+神经元。3周后，将光纤植入VTA上方，并在自由活动小鼠中记录VTAVGluT2+钙信号。在无条件本能厌恶实验期间，动物的足部接受0.5s的0.6mA电刺激，并记录VTAVGluT2+神经元的活动。在足部电击开始后，小鼠的VTA VGluT2+神经元的钙信号显著性的增加。动物在面对本能的厌恶刺激后诱发将近1.54s钙信号持续活动，平均的信号变化幅度达到4.26％(ΔF/F，n=8只)。为了检查重复的刺激对VTA VGluT2+神经元的影响，分析了逐个刺激的所有个体平均反应趋势，发现连续刺激中的钙信号的峰值响应始终保持在相似的水平。该实验证明VTA VGluT2+神经元被无条件本能的厌恶刺激强烈激活，并且峰值响应的幅度在实验中保持恒定。

Fig1 VTA VGluT2+神经元对不可预测的厌恶刺激的反应

(A)在VTA中注射AAV9-DIO-GCaMP6s的示意图；(B)光纤成像记录系统；(C)VGluT2-cre小鼠VTA中GCaMP6s病毒表达的代表图(绿色：GCaMP6s；比例尺：分别为200μm和20μm)；(D)每个动物的光纤位置；(E)304号动物VTA中VGluT2+神经元的Ca2+信号X显示电刺激诱发钙信号的增加(上图)；以黑色曲线代表的每次刺激的曲线图，红色曲线代表所有刺激的平均值；对应的热力图。T=0ms时给予动物足部刺激；闪电图表示足部电击示意图。(F-G)在所有动物中VTAVGluT2+神经元的平均钙信号变化进程显示VGluT2+神经元在电刺激中被激活(n=8只)；(H-I)所有动物每次电刺激的钙信号平均变化不随刺激次数的增加而变化；

为了表征VTAVGluT2+神经元对条件性化厌恶刺激的反应，采用以下实验方案：

1、适应阶段：动物随机接受5次连续5s中性声音(随机间隔：60-120s)；

2、条件化阶段：动物随机接受5次相同的5s中性声音刺激(条件化刺激，CS)，在声音持续到最后快结束前0.5s时，给小鼠足部0.5s的0.6mA电刺激(非条件化刺激，US)，并重复10次(随机间隔：60-120s)；

3、记忆测试阶段：在条件化24小时后，给予小鼠仅随机的呈现相同中性声音刺激(CS)；在适应阶段，VTAVGluT2+神经元对CS刺激不敏感，实验结果表明中性的CS不足以引起该神经元群体中的显著反应。在条件化阶段，相比适应性阶段，VTAVGluT2+神经元对CS刺激产生强烈激活。所有动物对US的刺激都有强烈的响应，该反应类似于上述无条件化的本能足部电击结果，US诱发的钙信号变化增量显著高于基线。

4、最后，在记忆测试阶段：CS刺激和US的预期这两个阶段的VTAVGluT2+神经元有显著的钙信号增加，其中CS诱发和US的预期诱发的反应幅度均高于基线水平。

文献引用：

1.Johansen JP, Diaz-Mataix L, Hamanaka H, Ozawa T, Ycu E, Koivumaa J, et al. Hebbian and neuromodulatory mechanisms interact to trigger associative memory formation. Proc Natl Acad Sci 2014.

2.Fiorenza NG, Rosa J, Izquierdo I, Myskiw JC. Modulation of the extinction of two different fear-motivated tasks in three distinct brain areas. Behav Brain Res 2012.

3.Mueller D, Porter JT, Quirk GJ. Noradrenergic Signaling in Infralimbic Cortex Increases Cell Excitability and Strengthens Memory for Fear Extinction. J Neurosci 2008.

4.Do-Monte FHM, Allensworth M, Carobrez AP. Impairment of contextual conditioned fear extinction after microinjection of alpha-1-adrenergic blocker prazosin into the medial prefrontal cortex. Behav Brain Res 2010.

5.Hugues S, Garcia R, Léna I. Time course of extracellular catecholamine and glutamate levels in the rat medial prefrontal cortex during and after extinction of conditioned fear. Synapse 2007.