动物行为与光电专题（43）丨小鼠场景记忆行为钙信号采集

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手术准备：

病毒注射完毕留针30min后，用微量注射器找到病毒注射位点的向上、向下、向左、向右1mm的四个点，即前囟后1.0mm（AP-1.0mm），旁开2.1mm（ML+2.1mm）；前囟后3.0mm（AP-3.0mm），旁开2.1mm（ML+2.1mm）；前囟后2.0mm（AP-2.0mm），旁开3.1mm（ML+3.1mm）；前囟后2.0mm（AP-2.0mm），旁开1.1mm（ML+1.1mm）这四个点，用三棱针轻轻标记后，换用颅钻将这四个点连成一个圆形，反复打磨直至露出脑组织。用三棱针整理钻孔周围的颅骨残渣，并用洗耳球轻吹清理，在此过程中应注意尽量不要让颅骨碎屑在脑内残留。调整显微镜，使创口正好位于镜头下方，并且视野清晰。将清洗消毒后的GRIN lens固定在夹持器上，调整夹持器，让GRIN lens刚好位于圆形创口上方。通过调节显微镜位置，选择一个能清晰观察GRIN lens植入大脑全过程的合适的角度。使GRIN lens缓慢下降至接近颅骨表面，由于颅骨的表面呈弧形，下降过程中选择GRIN lens的下表面一半已降至创口内，同时另一半尚未深入创口的高度标记为0点，然后匀速降低GRIN lens高度至-1.35mm。固定GRIN lens共需涂两次齿科树脂粘接。最后，用一层Kwik Sil胶厚厚覆盖在裸露在外的GRIN lens上，用以保护镜头，防止小鼠在日常活动中损坏镜头。待Kwik Sil胶完全干透，即可关掉麻醉机并将小鼠放在加热垫上恢复至可以走动。术后一周内，可给小鼠皮下注射抗生素、镇痛剂，并在供给小鼠的水瓶中加入抗生素。

GRIN lens埋置后四周左右，病毒表达充分，且组织基本愈合，此时可以进行图像采集测试及底座固定。将小鼠预麻后固定在立体定位仪上，用低剂量异氟烷使小鼠保持轻度麻醉状态，并用剪刀、镊子将Kwik Sil胶从GRIN lens顶部移除，用擦镜纸蘸取酒精对裸露在外的GRIN lens进行清洁。通过螺丝及吸铁石将底座与信号采集装置连接，放置在GRIN lens上方，并将信号采集装置连接至电脑，调整LED强度，调节增益，利用采集软件可视化实时观察成像情况。因为麻醉状态可能会影响神经元集群的可视化。手持信号采集装置，同时观察电脑屏幕成像画面，不断调整聚焦层面，选择最佳成像层面位置（包含最大数量成像清晰的细胞及有明显标记物的层面）作为最佳焦平面。确定位置后，用齿科树脂粘接剂固定底座，待齿科树脂粘接剂完全干燥后，通过螺丝及吸铁石固定防尘罩保护GRIN lens。  

小鼠在安置底座手术后恢复2~3天，再进行与行为学测试同步进行的钙信号采集。正式采集前实验者要再次确认焦平面和LED强度，通过反复测试，作者需要将可以在同一焦平面清晰成像的小鼠标记，这些小鼠使用同一个小显微镜。确定后，将定位螺丝拧入聚焦滑块，固定滑块，确保后续整个实验过程中对同一集群细胞进行成像，整个实验期间不再更改焦平面。同时，每只小鼠需要找到用于成像的最佳LED强度水平，确保可以看到清晰的成像，血管可以用作对齐框架的标志。在适应性训练过程中，也同步进行视频录制及初步分析，以确保在实验开始前各项设置已达到最佳，并在以后的采集过程中参考成像界面。

正式实验时，将微小显微镜与数据采集电子设备DAQ PCB连接，DAQ PCB与电脑连接，当DAQ上三灯亮起并且微小显微镜上的红灯亮起，则连接成功。数字成像数据将通过重量小且高度灵活的同轴电缆从CMOS成像传感器发送到定制的DAQ电子设备和USB主控制器并通过超高速USB将数据传输到运行自定义DAQ软件（UCLA miniscope）的电脑上，图像采集速度为每秒30帧。测试时确保小显微镜安装没有倾斜并将其固定在底座上，将实时成像与适应性训练过程中同一区域的成像进行比较，通过前期选取的作为标记的血管等确保每次成像都是同一界面，并且每次记录都应保证亮度的统一，如果成像画面差异较大则及时调整。实验过程中既要保证小鼠可以自由活动不受连线限制，又要注意连线不要太长以致于小鼠咬断连线导致信号采集中断。利用录屏软件同时记录小鼠行为学视频与钙成像视频。  

Fig1 信号采集系统示意图

记忆连接行为学测试

实验所需场景：

电击场景（shock context）：实验箱内底部放入可通电的铁栅栏，整个实验环境的形状近似于正方体，打开实验箱外的白光灯和风扇，此时实验箱体内灯光为白色，在实验开始前向实验箱内喷洒75%的酒精，房间整体保持弱光环境，利用空调稳定室内温度。每只小鼠的实验结束后，都应更换实验箱内的铁栅栏，替换下来的铁栅栏用清水洗净，用干净的擦手纸擦干后备用。

连接场景：场景B（linking context）：实验箱内底部放入可通电的铁栅栏，铁栅栏上铺有白色PVC板，实验箱内放入特制的黑色微透光PVC板，使实验箱的形状改变为横放三棱柱，打开实验箱外的白光灯，由于放置有黑色微透光PVC板，此时实验箱体内灯光为暗光，关闭实验箱内的风扇，在实验开始前向实验箱内喷洒气味剂B，并用擦手纸擦干环境内的残留液体，仅保留气味，房间整体保持弱光环境，利用空调稳定室内温度。每只小鼠的实验结束后，都应更换铁栅栏上的白色PVC板，替换下来的白色PVC板用清水洗净，用干净的擦手纸擦干后备用。场景C（linking context）：实验箱内底部放入可通电的铁栅栏，铁栅栏上铺有白色PVC板，其上再铺透明磨砂板，磨砂面朝上，保证小鼠可以接触磨砂面，实验箱内放入特制的白色PVC板以遮挡住实验箱体的三面，实验箱体顶部放有黑色微透光PVC板，其上再放红色透光塑料纸，打开实验箱外的白光灯和风扇，由于实验箱体顶部的黑色微透光PVC板和红色透光塑料纸，、实验箱体内灯光为红色暗光，在实验开始前向实验箱内喷洒气味剂C，并用擦手纸擦干环境内的残留液体，仅保留气味，房间整体保持弱光环境，利用空调稳定室内温度。每只小鼠的实验结束后，都应更换透明磨砂板，替换下来的透明磨砂板用清水洗净，用干净的擦手纸擦干后备用。  

新场景（novel context）：实验箱底部铺有黄色卡纸，实验箱内放蓝色卡纸遮挡实验箱体的三面，在每个方向贴上不同的标记，在实验箱内放置一个透明的小笼子其内粘有一个特制物体，并且要保证透明小笼子的高度，防止小鼠在活动过程中从笼内跳出，实验箱顶部放有红色透光塑料纸，打开实验箱外的白光灯，由于实验箱体顶部的红色透光塑料纸，实验箱体内灯光为红色光，关闭实验箱内的风扇，在实验开始前向实验箱内喷洒2%冰醋酸稀释液，并用擦手纸擦干环境内的残留液体，仅保留气味，房间整体保持弱光环境，利用空调稳定室内温度。每只小鼠的实验结束后，都应更换透明小笼子，替换下来的透明小笼子用清水洗净，用干净的擦手纸擦干后备用。

实验过程：  

在记忆连接行为学实验开始前，先单笼饲养小鼠8天，每天抚摸小鼠1分钟，连续4天，然后让小鼠适应从鼠房到实验室的运输环境和实验环境，连续4天，期间每天抚摸小鼠1分钟，并让小鼠适应实验箱1min，小鼠适应的实验箱与后期行为学测试过程中使用的实验箱保持一致。在后续整个行为学实验过程中，小鼠都需要单笼饲养。

实验第8天小鼠开始进行场景暴露。每只受试小鼠将在不同的时间间隔（如5h和24h）分别探索不同的场景（如场景B、C和A），每个场景的探索时间为10min。不同的连接场景暴露的先后顺序保持均衡以抵消可能的环境偏好。例如，第8天小鼠在24h场景中探索10min；第9天小鼠在5h场景中探索10min，5h后在电击场景中探索10min。每个场景大约800平方厘米，每种环境的形状，气味，灯光，风感和视觉线索都会有所不同。在场景暴露间隔期，小鼠返回生活笼（home cage）。电击场景暴露后24小时进行即刻足底电击。将受试小鼠置于电击场景（如场景A）,第11s给予1次0.65mA（2s）的足底电击，第18s给予第2次0.65mA（2s）的足底电击，电击结束58秒钟后，小鼠返回生活笼。场景测试时，小鼠将返回连接场景（如5h场景、24h场景）、电击场景（如场景A）以及新场景（如场景D），测试时间为5min，每个场景测试间隔1天。不同场景测试的先后顺序保持均衡以抵消先测试场景记忆的提取对后续测试场景记忆的可能影响。使用自动评分系统对小鼠5min内的僵立行为（freezing）,即除呼吸之外所有运动都停止且持续时间至少为1秒钟的状态，进行评估。  

Fig2 记忆连接场景测试示意图