同尾酶的选择

发现了一道考察同尾酶很经典的模拟题。

研究发现，枯草芽孢杆菌衣壳中的二氧四氢喋啶合酶（BsLS）能识别并结合核黄素合酶（BsRS）可能与核黄素合酶（BsRS）尾部的某些氨基酸序列有关。为确定相关氨基酸序列所在位置，科研人员扩增了核黄素合酶（BsRS）基因尾部三种不同长度的片段，将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测。相关信息如图所示。

(1)为将扩增后的产物定向插入载体并能与荧光蛋白基因正常表达出融合蛋白，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知，在R末端添加的序列所对应的限制酶是___，在F1、F2和F3末端添加的序列所对应的限制酶是__。

解析：

引物F1,F2,F3/R扩增的目的基因要正向插入载体，并能与荧光蛋白基因正常表达出融合蛋白。就要保证转录方向和荧光蛋白基因的转录方向一致。

这就需要扩增的目的基因F1,F2,F3引物一端和载体上的启动子相连，扩增的目的基因R引物一端和载体上的荧光蛋白基因相连。

首先，看载体上的限制酶可选的有SmaI和MumI。荧光蛋白基因中有EcoR1识别序列，因此EcoR1不能选。

其次，为了与载体相连接。扩增的目的基因F1,F2,F3引物应该在5’添加SmaI限制酶识别序列；

扩增的目的基因R引物应该在5’添加EcoR1限制酶识别序列，EcoR1和MumI是同尾酶，所以能连接。（不能选择MumI，因为目的基因中间有MumI识别序列）

(2)为使扩增的BsRS基因片段能与载体进行正确连接，需要选用___（填“E.coliDNA连接酶”或“T4DNA连接酶”），选择该酶的原因是___。本实验中，从产物扩增到重组载体构建完成的整个过程共需要___种酶。

解析：

扩增的目的基因两端用SmaI限制酶和EcoR1限制酶切割；

载体用SmaI限制酶和MumI限制酶（与EcoR1是同尾酶）切割；

还需要耐高温的DNA聚合酶和DNA连接酶。

(3)三种融合蛋白表达成功后，将对应的融合蛋白与BsLS混匀后、流经含BsLS抗体的介质，分离出与介质结合的物质后进行荧光检测。结果发现，含F1与R扩增产物的物质没有荧光，而含F2、F3与R扩增产物的物质有荧光，据此推测、BsLS识别并结合BsRS有关的氨基酸序列位于___。

解析：

F2、F3与R扩增产物的物质有荧光，

有荧光就代表有结合位点。

含F1与R扩增产物的物质没有荧光。

没有荧光就代表就没有结合位点。

所以结合位点应该位于F1和F2之间。

可以看出，就是改编自2021年山东卷的25题。

这道题确实花心思了。

我就想问一问，高二学生做这道题，能做出来吗？