CosMx空转数据分析导读

传统单细胞转录组技术（如 10X scRNA-seq）能获得高分辨率单细胞表达信息，但缺失了细胞在组织中的空间位置信息。空间转录组技术弥补了这一空白，能在组织切片上定位 RNA 分子，解析细胞在组织微环境中的分布与邻近关系。近年来，10x Visium、Slide-seq、Stereo-seq 等技术已被广泛应用。然而，这些技术通常是spot-based，空间分辨率有限，往往无法真正达到单细胞或亚细胞分辨率。

目前空间组学技术主要分为两大类：

（1）基于荧光成像 + 原位杂交/测序

通常可以达到单细胞甚至亚细胞分辨率，但基因通量有限（或需要多轮成像）：

(分辨率和通量仅供参考，技术迭代太快了)

这些平台的共同特点：

• 用原位荧光成像来定位 RNA 分子（或蛋白、ATAC 信号）
• 分辨率通常可以达到 亚细胞结构层面（细胞核/胞质可分辨）
• 数据处理复杂（spot calling，去卷积，image registration）

（2）基于空间捕获 + 高通量测序

分辨率一般为 spot 级，但不断提高，有些技术可以接近单细胞：

(分辨率仅供参考)

这些平台主要特点：

• 空间 resolution 取决于 spot / bead / bin size
• Stereo-seq 和 Seq-Scope 理论上可以做到亚细胞
• 但实际是否能做到 “功能意义上的单细胞/亚细胞” 还依赖 image registration、spot purity 等因素
• HD Visium (Visium HD) 可以做到 8 um bin，比较接近单细胞，但非原生 single-cell，可考虑进行细胞分割分析。

可以看到，空间转录组平台技术众多，但目前主流的具备单细胞或亚细胞分辨率的平台，主要包括 10x Xenium、NanoString CosMx、BGI Stereo-seq、10x Visium HD 以及 Slide-seq V2 等。

本文将重点介绍上述的热门技术之一CosMx 。

一、CosMx技术简介

NanoString 于 2022 年推出的 CosMx™ Spatial Molecular Imager (SMI) 是一种高通量、单细胞乃至亚细胞级别的空间原位分子成像平台。该技术结合了超高分辨率成像技术和多靶标检测能力，能够在单细胞及亚细胞分辨率下对超多靶标（RNA和蛋白）的空间原位信息进行可视化和定量分析。众所周知，FFPE样本的RNA和蛋白质往往质量较低、降解严重，因此对其进行分析极具挑战性。CosMx™ﾠSMI系统具有简单的样本制备流程和稳定的原位杂交化学原理，能够兼容多种组织类型的检测，包括新鲜冷冻组织（FF）、福尔马林固定石蜡包埋组织（FFPE）以及组织芯片（TMA）等。目前已有panel能够实现对6000种RNA和64种蛋白进行检测，能在保留靶标基因在组织原位空间信息的基础上，实现更高的基因组覆盖度，支持研究人员透彻解析组织和细胞异质性，深入研究背后的生物学功能，发现重要的生物标志物。

总结来说，CosMx具有以下特点：

• 兼容多种样本类型：包括石蜡包埋组织、新鲜冻存组织、穿刺样本、组织切片、组织芯片等多种类型；
• 检测靶标数：可同时检测组织切片中高达 6000 个RNA和64种蛋白质的空间表达模式；
• 原位单细胞识别：结合核染、膜染、形态学标记染色和AI算法进行准确的单细胞边界识别和界定;
• 空间分辨率：可以对切片做三维立体的成像分析，达到亚细胞的分辨率，精度高达 50 nm；
• 高灵敏度和高动态检测范围：在 1 mm² 组织区域内可检测约 100 万个细胞，可在单细胞水平捕获低拷贝数基因转录本；

应用场景包括：

• 单细胞空间图谱绘制：在空间背景下鉴定细胞类型、细胞状态、组织微环境表型和基因表达网络；
• 发现稀有细胞：实现更精细的细胞分型；
• 差异表达分析：基于空间背景的单细胞转录组及蛋白差异表达分析；
• 肿瘤微环境解析和细胞邻域分析：全面揭示组织微环境；
• 配受体配对与空间通信分析：配体-受体相互作用，揭示细胞间的相互作用机制；
• 空间生物标志物的发现和验证：识别空间背景下的单细胞生物标记物。

二、核心技术原理

CosMx SMI 技术采用预设 Panel 的原位杂交（smFISH）+ 多轮循环成像 + 解码，其关键步骤如下：

(1) 探针设计

• 每个基因对应 3–5 条探针，每条探针分为：
• 靶向结合区（35–50nt）：与目标 RNA 匹配，负责结合；
• 读出区（readout domain）：由 4 个 site domain 构成，供 Reporter 探针绑定；

所有探针通过设计“密码本”来确保 一一对应性与特异性。

(2) 多轮循环成像

• 使用 27 轮荧光成像，每轮注入不同 Reporter 探针（带荧光标签）与目标读出区结合；
• 通过轮次 + 荧光颜色形成“条形码”序列；
• 逐轮拍照、解码 → 获取每个点代表的基因/蛋白信息。

(3) 数据获取

• 不依赖扩增，采用直接成像，荧光点体积小、背景低、串扰少；
• 可同时记录：
• 每个分子的空间坐标
• 所属靶标信息（RNA 或蛋白）

三、技术优势

四、蛋白检测能力

CosMx 不仅检测 RNA，还支持蛋白质空间表达分析：

• 通过带有寡核苷酸标签的抗体识别蛋白；
• 在循环中与 Reporter 杂交后成像；
• 与 RNA 数据可实现联合分析（多模态空间组学）。

五、发表文献案例

这里列举一些我比较熟悉的文章，例如

• Conserved spatial subtypes and cellular neighborhoods of cancer-associated fibroblasts revealed by single-cell spatial multi-omics
• Integrative spatial analysis reveals tumor heterogeneity and immune colony niche related to clinical outcomes in small cell lung cancer
• Macrophage and neutrophil heterogeneity at single-cell spatial resolution in human inflammatory bowel disease
• CXCL9:SPP1 macrophage polarity identifies a network of cellular programs that control human cancers
• Spatial transcriptomics reveals discrete tumour microenvironments and autocrine loops within ovarian cancer subclones

这里可以通过这些文献总结一下cosMX数据的质控和基本分析流程。

ps: 听说cosMX技术仍存在一些诟病，例如FFPE样本存在一些非特异性信号，RNA弥散等问题，不知道这个是FFPE样本的通病，还是个例。