花青素还原酶（ANR）活性检测试剂盒实验解决方案

原理

花青素还原酶（Anthocyanidin reductase, ANR）是原花青素生物合成途径中的关键酶之一，可使花色素转变为相应的顺式黄烷-3-醇，对植物体内类黄酮类物质的合成、花色苷的积累，具有重要作用。CheKine 花青素还原酶（ANR）活性检测试剂盒（微量法）可检测生物体内ANR活性，其原理是：ANR可催化NADPH和花色素转化为黄烷-3-醇和NADP+，NADPH在340 nm有吸收峰，而NADP+没有；通过测定340 nm光吸收下降速率，计算ANR活性。

自备耗材

·酶标仪或紫外分光光度计（能测340 nm处的吸光度）

·96孔UV板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头

·制冰机、低温离心机、水浴锅

·去离子水、无水乙醇

·匀浆器

试剂准备

Extraction Buffer：即用型；内含不溶物，使用前摇匀；4℃保存。

ReagentⅠ：即用型；4℃保存。

ReagentⅡ：粉剂，临用前，96 T加入1.4 mL去离子水，48 T加入0.7 mL去离子水，充分混匀待用。用不完的试剂分装后-20℃保存一周，禁止反复冻融。

ReagentⅢ：粉剂，临用前96 T加入1 mL 50%乙醇，48 T加入0.5 mL 50%乙醇，充分混匀待用。用不完的试剂分装后-20℃保存一周，禁止反复冻融。

ReagentⅣ：粉剂，临用前96 T加入1 mL去离子水，48 T加入0.5 mL去离子水，充分混匀待用；4℃保存一周。

样本制备

注意：推荐使用新鲜样本，样本如果不是立即测定，可在-80℃保存一个月。

植物组织：称取约0.1 g样本，加入1 mL Extraction Buffer（注意混匀），进行冰浴匀浆，10,000 g，4℃离心10 min，取上清，置冰上待测。

注意：如需测定蛋白浓度，推荐使用Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。

实验步骤

1. 酶标仪或紫外分光光度计预热30 min以上，调节波长到340 nm。紫外分光光度计用去离子水调零。

2. 恒温箱预热到37℃。

3. 加样：

4. 混匀后，测量测定孔和对照孔在340 nm下的吸光度，分别记为A测定、A对照，计算ΔA=A对照-A测定。

注意：实验之前，建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA小于0.001，可适当加大样本量。如果ΔA大于0.4，样本可用Extraction Buffer进一步稀释（计算结果乘以稀释倍数），或减少提取用样本量。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

A. 使用96孔UV板测定的计算公式

1. 按照蛋白浓度计算

活性单位定义：每mg蛋白每分钟减少1 nmol NADPH为1个酶活单位。

ANR酶活(U/mg prot)=(ΔA÷ε÷d×V反总×109)÷(Cpr×V样)÷T×n=214.36×ΔA÷Cpr×n

2. 按照样本质量计算

活性单位定义：每g组织每分钟减少1 nmol NADPH为1个酶活单位。

ANR酶活(U/g 鲜重)=(ΔA÷ε÷d×V反总×109)÷(W×V样÷V样总)÷T×n=214.36×ΔA÷W×n

ε：NADPH摩尔消光系数，6.22×103 L/mol/cm；d：96孔UV板光径，0.5 cm；V反总：反应体系总体积，L，200 μL=2×10-4 L；109：1 mol=1×109 nmol；Cpr：蛋白浓度，mg/mL；V样：加入上清液体积，0.01 mL；T：反应时间，30 min；n：样本稀释倍数；W：样品质量，g；V样总：Extraction Buffer的体积，1 mL。

B. 使用微量石英比色皿测定的计算公式

将上述计算公式中的光径d: 0.5 cm调整为d: 1 cm进行计算即可。

结果展示

Figure 1. 玉米叶、芒果和葡萄中的ANR活性。