双荧光素酶实验原理及结果解读演示

双荧光素酶实验的原理是利用荧光素酶与底物结合发生化学发光反应的特点，把感兴趣的基因转录的调控元件克隆在萤火虫荧光素酶基因（firefly luciferase）的上游，构建成荧光素酶报告质粒。然后转染细胞，适当刺激或处理后裂解细胞，测定荧光素酶活性。通过荧光素酶活性的高低判断刺激前后或不同刺激对感兴趣的调控元件的影响。同时，为了减少内在的变化因素对实验准确性的影响，将带有海肾荧光素酶基因（rinilla luciferase)的质粒作为对照质粒与报告基因质粒共转染细胞，提供转录活力的内对照，使测试结果不受实验条件变化的干扰。

发光原理

双萤光素酶实验的具体步骤

1、报告基因质粒的构建。将目的片段插入到荧光素酶表达的报告基因载体上，如pGL3-basic。

2、转染细胞。将报告基因质粒和phRL-TK(内参)共转染细胞，根据需要对细胞进行处理。共转染时，由于内参具有很强的启动子，因此报告基因质粒：内参转染量一般为10:1~50:1。

Luciferase活性测定： 初次使用时，配制LAR II，即Firefly luciferase的底物。将LAR II溶解在LAR II buffer中，并分装-80℃避光保存。 加入1X PLB，室温裂解细胞15 min。配制Stop&Glo，即Renilla luciferase的底物，能够终止LAR II的反应。 测定荧光值。向40 ul的LAR II中加入10 ul细胞裂解液，吹打混匀后，检测读数，即为Firefly luciferase的值。加入40 ul Stop&Glo，再次读数，即为Renilla luciferase的值。 数据处理。首先计算出每管的Firefly luciferase/Renillaluciferase的比值，再以control组的比值为单位1，即可得到不同处理组的相对luciferase活性，也就是该处理组基因转录的调控活性。

结果解读

文献一：PMID: 28697764；IF=41.444

（1）方法

（2）结果

验证linc00673和miR-150-5p的结合情况。野生型linc00673可与miR-150-5p结合，但突变型linc00673却不能。通过构建荧光素酶报告载体，将荧光素酶与linc00673基因链接，然后转染到细胞内检测荧光活性。结果表明，miR-150-5p mimics显著降低了野生型linc00673的荧光素酶活性，但对突变型linc00673荧光素酶活性没有影响。以上结果表明，linc00673可与miR-150-5p结合。

文献二：PMID: 35963157；IF=5.741

（1）方法

（2）结果：

验证YAF2和miR-217-5p的结合情况。野生型YAF2可与miR-217-5p结合，但突变型YAF2却不能。通过构建荧光素酶报告载体，将荧光素酶与YAF2基因链接，然后转染到细胞内进行检测。结果表明，miR-217-5p mimics显著降低了野生型YAF2的荧光素酶活性，但对突变型YAF2荧光素酶活性没有影响。以上结果表明，YAF2可与miR-217-5p结合。

文献三：PMID: 35212607；IF=6.832

（1）方法

（2）结果

本研究验证了PEG10和miR-449a以及RPS2与miR-449a的结合情况。这里以PEG10和miR-449a为例。野生型PEG10可与miR-449a结合，但突变型PEG10却不能。通过构建荧光素酶报告载体，将荧光素酶与PEG10基因链接，然后转染到细胞内进行检测。结果表明，miR-449a mimics显著降低了野生型PEG10的荧光素酶活性，但对突变型PEG10荧光素酶活性没有影响。证明PEG10与miR-449a靶向结合。

文献四：PMID: 35110549；IF=9.685

（1）方法

（2）结果

验证PAARH和HOTTIP分别与六种miRNA的结合。以上结果显示，miRNA转染组的荧光活性显著降低，表明miRNA与PAARH和HOTTIP之间存在靶向结合。

注意该研究中没有突变型的结果，这样的例子很少，一般荧光素酶的结果是需要包括突变型和野生型的，自己设计实验的时候注意一下。

所用耗材：

NEST酶标板