中药单体与靶蛋白结合验证（一）：分子互作实验四大金刚

佰莱博生物：一站式分子互作实验服务

传统中药具有悠久的历史，使用了大量的天然植物、矿物和动物药物，疗效显著，但其具体作用机制往往不清晰。揭示中药单体的结合靶点，可以帮助科学家揭示中药如何在分子和细胞层面上发挥其疗效，提高药物的精准治疗能力，避免无效或有害的治疗效果。这有助于从现代生物医学角度理解中药的复杂效应，填补传统医学与现代医学之间的空白。

验证中药单体与靶点蛋白结合的方法有哪些？下面为大家介绍一篇高分文章案例，这些文章中运用了多种中药单体结合靶点验证方法，分别是：分子对接、分子动力学模拟、MST微量热泳动MST、SPR表面等离子共振技术、ITC等温滴定量热法、细胞热迁移技术（CETSA）、药物亲和反应靶点稳定性分析 (DARTS)、小分子 Pull Down 技术。

01.

四大技术验证中药单体与靶蛋白结合

分子对接与分子动力学模拟：预测与验证的完美搭档

分子对接技术像是一场虚拟的“拼图游戏”，将中药单体与靶点蛋白的结构进行匹配，预测它们之间可能的结合方式和亲和力。

而分子动力学模拟则像是给这场游戏加上了时间维度，观察它们在一定时间内的相互作用是否稳定。这种组合不仅能够提前筛选出有潜力的靶点，还能为后续实验提供理论依据。

SPR/MST/ITC：亲和力精准测量的“三剑客”

表面等离子共振技术（SPR）、微量热泳动技术（MST）和等温滴定量热技术（ITC）是精准测量中药单体与靶点蛋白相互作用亲和力的“三剑客”。

SPR能够实时监测它们之间的结合和解离过程，给出精确的亲和力数据；MST则通过分子间结合变化引起的分子热泳动速率变化，精确测量分子间结合的亲和力数值；ITC直接测量它们结合时释放或吸收的热量，从而计算出结合的亲和力和热力学参数。

这三种技术相互佐证，为中药单体与靶点蛋白的结合提供了全方位的精准验证。

CETSA/DARTS：细胞环境中的结合验证

细胞热迁移技术（CETSA）和药物亲和反应靶点稳定性分析（DARTS）将研究带入了细胞环境。

CETSA通过观察药物处理后靶点蛋白的热稳定性变化，判断它们是否发生了相互作用；DARTS则是通过检测药物处理后靶点蛋白在蛋白酶处理后的水解情况，进一步验证它们的结合。

这两种技术能够在更接近生理条件的环境中，验证中药单体与靶蛋白的相互作用，为药物的体内作用机制研究提供了有力支持。

Small-Pull Down：直观的“抓取”实验

小分子Pull Down技术是一种直观的“抓取”实验。通过将带有生物素标记的中药单体与细胞裂解物混合，再利用链霉亲和素磁珠进行“抓取”，最后通过质谱分析检测是否“抓取”到了靶点蛋白。

这种方法能够直接证明中药单体与靶点蛋白在细胞裂解物中的相互作用，为靶点的验证提供了直观的证据。

02.

研究案例

分子对接+MST/ITC+CETSA/DARTS+Pull Down技术验证PRDX1蛋白是单体化合物pochonin D的作用靶标，且Cys173位点是pochonin D与PRDX1蛋白结合的关键氨基酸位点

2025年，中国药科大学汪哲团队在期刊《ACS Central Science》（一区，IF=12.7）上发表了题为“Discovery of Natural Resorcylic Acid Lactones as Novel Potent Copper Ionophores Covalently Targeting PRDX1 to Induce Cuproptosis for Triple-Negative Breast Cancer Therapy”的文章，发现Pochonin D能够靶向PRDX1蛋白的Cys173位点，通过抑制PRDX1的酶活性，干预铜死亡（Cuproptosis），从而发挥抗三阴性乳腺癌（TNBC）活性。

研究中，他们综合运用了分子对接、MST、ITC、CETSA、DARTS和Pull Down等多种技术，从不同角度验证了Pochonin D与PRDX1的结合，揭示了其抗TNBC的作用机制。这一发现不仅为TNBC的治疗提供了新的潜在药物，也为中药单体靶点验证提供了经典案例。

文章研究思路

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本研究中，作者为了验证PRDX1蛋白是化合物pochonin D(PoD)直接作用靶点，采用了生物物理技术、生物化学技术、体外酶活测试分别进行验证。

生物物理技术包括微量热泳动技术(MST)和等温滴定量热法（ITC），生物化学技术包括细胞热迁移技术 (CETSA)、药物亲和反应靶点稳定性分析(DARTS)、小分子pull down实验。

微量热泳动（MST）实验证明：PoD能以较高的亲和力与PRDX1蛋白结合 (Kd = 0.77 μM)（图1A，1B)。等温滴定量热法（ITC）实验进一步验证了上述结果，测得PoD与PRDX1蛋白的亲和力为0.675 μM（图1C，1D）。

细胞热迁移实验（CETSA）结果也显示，与对照组DMSO相比，PoD增加了PRDX1蛋白的热稳定性（图 1E、1F）。

药物亲和反应靶点稳定性分析(drug affinity responsive target stability, DARTS)实验结果表明，PoD可减少PRDX1蛋白水解（图1G，1H），这证实了PoD与PRDX1的相互作用。

小分子Pull-Down实验也显示：当细胞在MDA-MB-231和4T1细胞裂解物中使用PoD预孵育时，PoD-biotin下拉PRDX1的能力受到了显著影响，进一步证明PoD与PRDX1的存在相互作用（图1I，1J）。

酶活测试结果也表明：PoD抑制PRDX1活性，IC50值为0.49 μM（图1K）。

图1 验证PRDX1蛋白是单体化合物PoD直接作用靶点

此外，为了验证半胱氨酸Cys 173是Pochonin D与 PRDX1蛋白的共价结合位点。作者采用了分子对接+微量热泳动技术（MST）+细胞热迁移技术（CETSA）+小分子 pull down实验+药物亲和反应靶点稳定性分析 (DARTS）实验进行了验证。

PoD的α，β-不饱和酮部分，可作为反应性Michael受体与蛋白质中的半胱氨酸残基形成共价键。作者通过比较缺乏该官能团的衍生物monordene E与 PoD进行细胞增殖实验，证明：PoD的细胞毒性依赖于α，β-不饱和酮部分（图2A，2B）。PRDX1含有4个半胱氨酸（Cys52、Cys71、Cys83和Cys173）。

作者采用了分子对接技术模拟PoD与 PRDX1蛋白结合的氨基酸位点（图2C-2F），结果显示：PoD与PRDX1蛋白共价结合。随后，作者将四个半胱氨酸（Cys52、Cys71、Cys83和Cys173）突变为丙氨酸。

MST结果显示：当Cys173突变后，PoD与PRDX1的结合消失，说明 Cys 173是PRDX1上Pochonin D的共价结合位点。此外，作者还进行了CETSA、DARTS和小分子pull-down实验，结果显示，与其他突变型PRDX1相比，突变体PRDX1(cys173A)没有与PoD结合（图2H-2J）。

综合上述结果：PoD通过其α，β-不饱和酮部分与PRDX1共价结合，并特异性靶向PRDX1蛋白的Cys173。

图2 验证Cys 173是Pochonin D与PRDX1蛋白的共价结合位点

03.

参考文献

[1] Feng L, Wu T Z, Guo X R, et al. Discovery of Natural Resorcylic Acid Lactones as Novel Potent Copper Ionophores Covalently Targeting PRDX1 to Induce Cuproptosis for Triple-Negative Breast Cancer Therapy[J]. ACS Central Science, 2025

链接：

https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/acscentsci.4c02188

佰莱博生物提供基于生物信息学、生物物理、生物化学以及细胞水平的分子互作筛选及验证服务。

(1) 生物物理实验：

ITC、SPR、MST、BLI、DSF、nanoDSF、MALS（动静态光散射）、AUC（分析型超离）、CD（圆二色光谱技术）

(2) 生物化学实验：

CETSA、Small Pull-Down、GST Pull-Down、Co-IP 、DARTS

(3) 细胞生物学实验：

小分子免疫荧光（小分子荧光共定位）

(4) 计算模拟实验：

虚拟筛选、分子对接、分子动力学模拟、基于AI的蛋白质设计

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