化合物与靶蛋白结合验证：SPR+MST+DSC+小分子pull down验证益母草碱靶向ADIPOR2发挥保护肝脏的功能

佰莱博生物：一站式分子互作实验服务

01.

技术简介

1.

表面等离子共振

Surface Plasmon Resonance

表面等离子共振(SPR，Surface Plasmon Resonance)是一种基于光学的生物分子相互作用检测方法。为研究两个分子之间的相互作用，其中一个分子被固定到芯片表面上，而另一个分子以溶液的形式连续流过芯片表面，两个分子结合或解离会引起芯片表面质量的变化，芯片表面质量的变化会引起SPR角的变化，且SPR角(响应值RU)的变化与芯片表面质量变化呈现线性关系，从而可以实现实时检测两个分子的结合和解离过程。

2.

微量热泳动

MicroScale Thermophoresis

微量热泳动 (MST) 技术利用分子在温度梯度场中的热泳动现象来检测生物分子间的相互作用亲和力。其基本原理是，当靶蛋白与配体结合时，其构象、水化层及分子大小会发生改变，进而影响其在温度梯度场中的泳动行为。通过监测这种泳动行为的变化，即可测定亲和力。

3.

DSC技术

Differential scanning calorimetry

DSC技术通过测量蛋白质在升温过程中的热变性（解折叠）所吸收的热量，确定其特征变性温度（Tm）。当化合物与蛋白质结合后，会改变蛋白质的热稳定性，导致其变性温度（Tm）变化。DSC检测并量化这种由结合引起的Tm变化，以此作为蛋白质与化合物发生结合的证据。

02.

高分文章分享

Nature communication | 同济大学附属同济医院团队通过SPR、MST、DSC等技术验证SCM-198靶向ADIPOR2发挥肝脏保护功能

2024年，同济大学附属同济医院团队在Nature communication发表题为“Selectively targeting the AdipoR2-CaM-CaMKII-NOS3 axis by SCM-198 as a rapid-acting therapy for advanced acute liver failure”的文章。作者发现SCM-198不仅能够预防，并且还能治疗TAA、APAP或LPS/D-GaIN诱导的ALF，并且通过SPR等手段探究了其发挥功能的分子机制。

研究思路小结

03.

主要研究内容

1.SCM-198作用靶点鉴定

作者首先在TAA或APAP的成年小鼠中验证了SCM-198对ALF的治疗作用。

为了研究SCM-198的作用机制，作者采用了亲和纯化的方法来鉴定SCM-198的作用靶点。作者首先合成了生物素化的SCM-198探针，确定此探针对细胞无毒性（图1a），定位于细胞膜（图2c），并且和SCM-198一样具有类似的保护作用（图2b），随后通过探针去钓取AML12肝细胞膜蛋白中的靶点（图2d），通过质谱鉴定，发现ADIPOR2是SCM-198的潜在靶点。

图1 亲和纯化鉴定SCM-198作用靶点

2.SCM-198和ADIPOR2直接相互作用验证

为了验证ADIPOR2蛋白和SCM-198的相互作用，作者首先纯化了ADIPOR2蛋白，利用SPR（表面等离子共振）技术，验证了蛋白和SCM-198的相互作用，kD值为1.990uM（图2c），基本实验流程如下：先将CM5芯片活化，随后将ADIPOR2蛋白通过氨基偶联的方法固定在芯片上，将SCM-198使用PBS缓冲液稀释成6个浓度（50、25、12.5、0.79、0.39、0.2 uM），以30 ul/min的速度进样150s，然后使用10 mM甘氨酸缓冲液以10 ul/min的速度再生5min，数据使用BIAcore T200 Control software进行处理；通过MST（微量热泳动）技术，得出ADIPOR2蛋白和SCM-198的解离常数kD值约为2.308uM（图2b）；并且，通过DSC（差示扫描量热法），发现SCM-198能明显改变ADIPOR2蛋白的Tm值（从62.8提高为68.6℃，图2a）。

为了预测ADIPOR2蛋白和SCM-198的结合模式，作者采用了分子动力学模拟和超高分辨率LC-MS的方法，发现R335和R331是与SCM-198相互作用的主要氨基酸残基（图2d）。随后作者构建了5个ADIPOR2突变体，通过小分子pull down实验，发现R311A和R335A突变体与化合物的相互作用明显减弱（图3e），随后对两个突变体进行了SPR表面等离子共振检测，R331A突变体的kD值为9.9162uM（图3f），R335A的kD值为50.06uM（图3g），这一结果表明R335对于蛋白和化合物的结合十分重要。

图2 ADIPOR2蛋白与SCM-198直接相互作用验证

SPR表面等离子共振实验方法

Experiments were performed in triplicate at 25 °C on a BIAcore T200 using CM5 sensor chips, and data were analyzed using BIAcore T200 Evaluation software (GE Healthcare) following the manufacturer’sinstructions. In brief, a cell on the CM5 sensor chip was activated with a mixture of 200 μM 1-Ethyl-3- [3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride (EDC) and 50 μM N-hydroxysuccinimide (NHS) at 10 μL min−1 for 10 min. A total of 20 μL of AdipoR2 protein (1 μg μL−1 ) purified as described above and adjusted to pH 4.0 (by mixing with 180 μL of 10 mM sodium acetate solution, pH 4.0) was then immobilized on the surface of the cell at 10 μL min−1 for 5 min for two repetitive runs. The cell was then blocked with 1 M Ethanolamine (10 μL min−1 for 10 min). SCM-198 stock solution (1 mM) was diluted to a series of concentrations (50.00, 25.00, 12.50, 0.79, 0.39, and 0.20 μM (all in PBS)) and was flowed at 30 μL min−1 for 150 s in each run. At the end of each flow, proteins were regenerated for 5 min with 10 mM glycine-HCl

(pH 2.0) solution at 10 μL min−1 . Data from the sample protein were collected using BIAcore T200 Control software (v. 2.0, GE Healthcare) from the reference protein. The association and dissociation constants were calculated using a global fit data fit to a 1:1 binding model using BIAcore T200 Evaluation software (v.2.0, GE Healthcare). The data was exported to generate the final figures.

DSC差示扫描量热实验方法

Differential scanning calorimetry assays were performed on a VP-DSC (GE Healthcare). The VP-DSC was run on a mode without feedback, and 15 min of equilibration at 20 °C was performed before and between each scan. The scanning range was set from 20 to 80 °C, and the heating rate was 90 °C h−1 . The instrument was pre-equilibrated by running for five heating-cooling cycles with both the sample cell and the reference cell loaded with PBS. The sample cell was then loaded with 10 μL of AdipoR2 protein at 1 μg μL−1 in 10 μM SCM-198 (in DMSO), or DMSO control, and curves of heat capacity (Cp) versus temperature were recorded. Data were collected using VPViewer 2000 software (v2.66.7, GE Healthcare) corrected for PBS baselines, and normalized for scan rate and protein concentration.

MST微量热泳动实验方法

To determine the binding affinity of SCM-198 and ADIPOR2, an MST assay was conducted. Monolith NT.115 (NanoTemper Technologies) was used. ADIPOR2 was labeled with the Monolith NT Protein Labeling Kit RED (NanoTemper Technologies) according to the supplied labeling protocol. Labeled AdipoR2 was used at a concentration of ~ 20 nM. SCM-198 was titrated in 1:1 dilutions beginning at 25 μM, which contained 1.25% (v/v) DMSO. The samples were diluted in a MAT assay buffer. The mixture consisted of 100 mM Tris-HCl pH 8.0, 20 mM MgCl2, and 200 mM KCl. DMSO should be at a final concentration of 1.25% to guarantee accuracy. All samples have the same DMSO concentration. The pieces were filled into premium-coated capillaries for measurement.

3.SCM-198的小鼠ALF保护作用依赖于ADIPOR2

作者构建了ADIPOR2敲除的小鼠，探究SCM-198对于小鼠的ALF是否仍具有治疗效果。与野生型小鼠相比，经过SCM-198处理后，敲除小鼠中高水平坏死持续存在（图3a、b），并且也不能降低血清ALT和AST水平或增加肝组织中的GSH水平（图3d）。经SCM-198处理的敲除小鼠的肝脏也表现出重度无菌性炎症，较高的巨噬细胞活化程度（图3e），较高的血清TNF-α水平（图3f）。这些体外和体内实验表明，AdipoR2介导了SCM-198的肝脏保护作用。

图3 SCM-198的小鼠ALF保护作用依赖于ADIPOR2

04.

参考文献

Wang R, Chen Y, Han J, et al. Selectively targeting the AdipoR2-CaM-CaMKII-NOS3 axis by SCM-198 as a rapid-acting therapy for advanced acute liver failure. Nat Commun. 2024;15(1):10690. Published 2024 Dec 16. doi:10.1038/s41467-024-55295-7

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