速看：微量热泳动 (MST) 技术助力多个分子间竞争性结合分析

微量热泳动技术 (Microscale Thermophoresis，MST)是一种定量分析生物分子间相互作用

的前沿技术，通过精确检测荧光变化，结合灵敏的热泳动现象，定量分析分子间相互作用。实验时对互作分子中的一个分子进行荧光标记，使之成为非常灵敏的标签分子，在 MST 技术中称之为 Target；与之互作的另一个分子称之为 Ligand。Target 分子与 Ligand 分子结合形成复合物，复合物分子的尺寸、水化层和电荷的改变都可以导致复合物分子的热泳动速度相对于 Target 分子热泳动速度发生改变，因此很容易检测到 Target 与 Ligand 分子的结合引起的微量热泳动 (MST)信号变化 (图1)。

图1 MST 技术原理

微量热泳动 (MST) 竞争性结合分析实验设计：以 A、B 分子竞争性结合 C 分子为例，一般将 C 分子作为 Target 分子 (标记荧光)，实验时需要用浓度大于 A-C 亲和力数值的 A 分子与 Target 分子 (荧光标记的 C 分子) 混合，以确保绝大多数 C 分子都能被 A 分子结合，再将 B 分子进行2倍梯度稀释 (16个浓度)，开展 B 分子与 A-C 混合体系的 MST 实验。

图2 微量热泳动技术 (MST) 检测 A、B 分子竞争性结合 C分子

案例一

微量热泳动 (MST) 技术在

水稻针对稻瘟菌的免疫机制研究中的应用

2019 年，发表在 The Plant Cell 上题为 “Binding of the Magnaporthe oryzae Chitinase MoChia1 by a Rice Tetratricopeptide Repeat Protein Allows Free Chitin to Trigger Immune Responses” 的研究论文。研究人员鉴定出一种由稻瘟菌 (M.oryzae) 分泌的几丁质酶MoChia1(Magnaporthe oryzae chitinase 1)，能够结合几丁质从而抑制植物免疫反应[1]。

图3 MST 技术验证 OsTPR1 和几丁质竞争结合 MoChia1

微量热泳动(MST)实验结果表明， MoChia1 与 OsTPR1 之间的亲和力 (Kd) 为0.052μM(图3左)，MoChia1 与几丁质 (Chitin) 的亲和力 (Kd) 为0.31 μM (图3右)，同时，OsTPR1 不与几丁质结合 (图3右)。在MST 竞争性分析实验中，作者将 MoChia1 和 20μM OsTPR1 孵育后，发现 MoChia1 与几丁质 (Chitin) 的亲和力降低了一个数量级 (Kd=1.34μM)。而在将 OsTPR1 浓度提高到 100μM 后，MoChia1 与几丁质间无结合。表明 OsTPR1 和几丁质竞争结合 MoChia1，从而释放几丁质，激活免疫反应。

通过微量热泳动(MST)技术，研究人员发现水稻中的四肽重复蛋白 OsTPR1 竞争性地结合 MoChia1，从而允许游离几丁质的积累并重新建立免疫应答。研究表明，水稻植物不仅可以识别 MoChia1，还可以使用 OsTPR 来抵消其几丁质酶的功能，从而恢复免疫。

Microscale thermophoresis (MST) analysis

Binding reactions of recombinant MBP-MoChia1 to MBP-OsTPR1 or chitin was measured by microscale thermophoresis which detects changes in size, charge and conformation induced by binding. Labeled MBPMoChia1 (10 μM) was displaced by a buffer containing 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 10 mM MgCl2 and 0.05% (V/V) Tween-20. A range of concentrations of MBP-OsTPR1 or chitin in the assay buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.8, 150 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 0.05% Tween-20) was incubated with labeled protein (1:1, v/v) for 10 minutes. The sample was loaded into the NT. Label Free standard capillaries and measured with 20% LED power and 80% MST power. The KD Fit function of the Nano Temper Analysis Software (Version 1.5.41) was used to fit the curve and calculate the value of the dissociation constant (Kd).

案例二

微量热泳动 (MST) 技术在细菌 c-di-GMP

调节硝酸盐同化分子机制研究中的应用

环二鸟苷酸 (c-di-GMP) 是一种细菌中广泛存在的第二信使，它通过下游受体调节生物被膜形成、运动性和细菌毒力等多种生理功能。2023年发表在 Nucleic Acids Research杂志在线发表题为“Cyclic di-GMP inhibits nitrate assimilation by impairing the antitermination function of NasT in Pseudomonas putida”的研究论文。该研究揭示了细菌第二信使 c-di-GMP 通过其受体 NasT 调控恶臭假单胞菌的硝酸盐同化过程的分子机制[2]。

在微量热泳动 (MST) 实验中，研究人员通过表达纯化 NasT-GFP 融合蛋白 (纯化 GFP 融合蛋白可以避免宿主蛋白对 MST 实验的干扰)，再利用 MST 技术测定 NasT-GFP 融合蛋白与 c-di-GMP 的亲和力，结果发现 NasT-GFP 融合蛋白能够与 c-di-GMP 结合，且亲和力值 Kd 为 6.49 ±2.44 μM，而 GFP 蛋白不与 c-di-GMP 结合 (图4)。

图4 MST 技术验证 NasT 特异性结合 c-di-GMP

此外，研究人员采用微量热泳动(MST) 技术竞争结合分析实验发现：NasT- GFP 融合蛋白能与 nirBD 操纵子前导 RNA (NalA) 结合，亲和力 Kd 值为0.27 ± 0.12 μM，而 GFP  蛋白不与 NalA 结合，说明 NasT 能与 NalA 结合；但是当体系中分别加入不同浓度的 c-di-GMP 后，随着 c-di-GMP 浓度的升高，造成 NasT 与 NalA 亲和力 Kd 值升高，亲和力减弱 (图5)。说明高水平 c-di-GMP 抑制 NasT 与 NalA 的结合，进而抑制 NasT 的抗终止功能，导致 nirBD 转录水平下调。

图5 NasT- GFP、c-di-GMP 与 NalA 竞争性结合分析

Microscale thermophoresis (MST) assay

MST was performed to analyze the interaction between NasT and c-di-GMP/NalA. A green fluorescent protein (GFP) encoding gene was fused to the end of nasT in pET-28a-nasT to achieve fusion expression. The fusion protein NasT-GFP was induced and purified as described above in protein library construction. The obtained NasT-GFP was dialyzed with MST buffer (50 mM Tris–HCl [pH 7.8], 150 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 0.05% Tween 20). Commercially available c-di-GMP (Biolog Company C057, Germany) was resolved with ultrapure water. GFP protein was used as the negative control. The MST assay was performed on a Monolith Instrument NT.115 device using standard treated capillaries (NanoTemper Technologies, Germany). The concentration of NasT-GFP/GFP was constant at 50 nM, and the concentration of c-di-GMP/NalA was varied from 0.024 to 800 μM (c-di-GMP) or 0.91 to 15 000 nM (NalA) with a 2-fold gradient. The experiment was recorded using the Nano-BLUE fluorescent detector. Measurements were performed in MST buffer. The MO. Affinity Analysis software (version 2.3) was used to calculate the dissociation constant (Kd) from triplicate reads of measurements.

参考文献

[1] Yang, Chao, et al. "Binding of the Magnaporthe oryzae chitinase MoChia1 by a rice tetratricopeptide repeat protein allows free chitin to trigger immune responses." The Plant Cell 31.1 (2019): 172-188.

[2] Nie, Liang, et al. "Cyclic di-GMP inhibits nitrate assimilation by impairing the antitermination function of NasT in Pseudomonas putida." Nucleic Acids Research 52.1 (2024): 186-203.

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