缺氧相关基因预测模型这样分析依旧可以发2区4分+SCI

大家好，这次给大家分享得文献是A hypoxia-related signature for clinically predicting diagnosis, prognosis and immune microenvironment of hepatocellular carcinoma patients，2020年9月发表在Journal of Translational Medicine杂志上，影响因子4.124。文章主要是寻找肝细胞癌诊断、预后和复发的特征基因并构建预测模型，所用方法比较常见但篇幅很长！

研究流程图

结果

1. HCC缺氧相关差异基因的鉴定

从TCGA数据库中的HCC和邻近非癌组织鉴定了DEGs (|LogFC|> 1，P < 0.05)。然后，在GEO数据库的两个数据集的缺氧处理和未处理的HCC细胞系中得到缺氧相关基因，取三者的交集共获得397个与HCC缺氧相关的DEGs (图1a)。GO富集分析发现这些基因在DNA复制、细胞分裂、细胞周期以及免疫受体的体细胞多样化中得到富集(图1b)。

图1

2. 利用缺氧相关基因对HCC分子亚组进行一致聚类

使用ConsensusClusterPlus R软件包对397个缺氧相关基因的表达谱进行一致聚类。当k = 4时，聚类结果、CDF面积变化曲线，一致性项目图都显示出稳定的结果(图2a、b、c)。最后建立了一个一致性矩阵图，其中397个deg被分配给4个聚类亚组 (图2d)。4个簇中397个缺氧相关DEGs的热图如图2e所示。

生存分析结果显示了这4个亚组的生存概率和复发率的显著差异。与其他三个聚类相比，聚类-2中的样本具有最差的预后和最高的复发率(图3a，b)。作者进一步分析了这4个亚组中甲胎蛋白的分布、性别、血管浸润程度、TNM分期、病理分级和年龄(图3c)发现聚类-4中的样本与高AFP表达水平、未分化肿瘤细胞和淋巴转移相关，而聚类-3显示出远处转移的高发生率；聚类-2具有较高的血管浸润程度和较多的低分化肿瘤细胞。此外，聚类-2中的大多数患者为男性，年龄一般在65至70岁之间，且聚类-2显示出比其他三个组群更高的TMB(图3d，e)。

图2

图3

3. 构建和验证缺氧相关预后特征

单变量Cox回归分析筛选出291个DEG与HCC病患者OS相关的基因。进一步的LASSO回归筛选出11个DEG。最后，通过多变量Cox回归确定了三个基因(PDSS1，SLC7A11，CDCA8)并构建预后模型:预后指数(PI)=(0.337 * PDSS1的表达水平)+(0.383 * SLC 7a 11的表达水平)+(0.356 * CDCA 8的表达水平)。使用X-tile软件得出的风险分数的最佳截止值为2.296，来自TCGA-LIHC的患者被分为高风险组和低风险组。K-M曲线显示高危组的OS明显差于低危组 (图4a)。0.5年、1年、3年和5年总生存率(OS)的时间相关ROC曲线下面积分别为0.76、0.78、0.7和0.7，表明该预后模型具有良好的预测性能(图4c)。使用ICGC数据库的HCC样本进一步验证了这种预测特征的预测能力(图4b)。三基因预后模型的AUC为0.68，0。0.5、1、3和4年存活时间分别为75、0.77和0.77(图4d)。

图4

4. TCGA的HCC队列评估预后信号的独立作用并建立预测模型的列线图

单变量和多变量Cox回归分析用于评估预后模型的预测值是否独立于其他传统临床特征。结果显示，TNM分期和风险评分是OS的独立预后因素(图5a)。然后作者建立了一个预测列线图 (图5b)来预测患者1年、3年和5年的生存概率。列线图内部验证的校准图显示了预测的操作系统结果和实际观察结果之间更好的一致性(图5c–e)。TNM分期、预测模型和列线图的C指数分别为0.54、0.65和0.66，进一步表明列线图具有较高的预测一致性。在预测1年、3年和5年OS时，列线图的AUC分别为0.672、0.684和0.675，优于单一独立因素的预测模型(图5f–h)。用DCA评价这些模型对临床应用的指导意义，结果表明组合模型是预测OS的最佳模型(图5i-k)。

图5

5. 缺氧相关基因预测HCC病复发的价值

TCGA-LIHC队列含有无病生存期(RFS)信息和复发状态的HCC患者被当作训练集，GSE14520的患者被用作验证集。基于这三个缺氧相关基因，利用多变量Cox比例风险的回归系数(β’)构建了一个复发特征。预后指数(PI)=(0.060 * PDSS1表达水平)+(0.045 * SLC 7a 11表达水平)+(0.041 * CDCA 8表达水平)。在训练和验证组中，患者根据风险评分0.953和1.247分为高风险组和低风险组 (图6a)。生存分析显示，高危组患者的复发率明显高于低危组(图6b，e)。ROC分析显示复发模型的预测准确性(图6c)。与其他预后模型相比，分别为0.64、0.6和0.6缺氧相关信号、甲基化驱动的预后模型和三基因预后模型的AUC值分别为分别为0.64、0.6和0.6 (图6d)。这些结果表明我们的缺氧相关复发模型具有更可靠的预测能力。

图6

6. 建立预测HCC病患者复发概率的列线图并评估其预测性能

通过单变量和多变量Cox回归分析，筛选出了与HCC复发相关的三个独立因素 (图7a)。通过整合这三个因素建立预测肿瘤复发的列线图(图7b)。列线图的校准图显示了预测和观察之间的一致性(图7c–e)。年龄、TNM分期、预后模型和列线图的C指数分别为0.62、0.56、0.63和0.71。从图7f-h的ROC分析结果来看，列线图在1年、3年、5年的AUCs分别为0.746、0.741、0.717，明显高于其他独立因素模型。DCA曲线显示，组合模型获得了更高的净收益(图7i–k)。

图7

7. HCC缺氧相关基因诊断模型的建立

利用逐步罗杰斯特回归方法构建了基于这三个缺氧相关基因的诊断模型。诊断评分:logit(P = HCC)= 1.171+(0.571)×PDSS1表达水平+(1.019)×SLC 7a 11表达水平+(2.037)×CDCA 8表达水平。在50个正常样本与50个HCC样本配对的TCGA队列中，诊断模型实现了94%的敏感性和92%的特异性(图8a)。以ICGC队列的190个正常样本与219个HCC样本配对作为验证集，诊断模型获得了90%的敏感性和94%的特异性(图8c)。ROC分析结果显示(图8b，d)，在TCGA和ICGC队列中，模型的AUC分别达到0.986和0.962。为了进一步验证该模型的临床应用，作者收集了一组源自患者的组织，其中13个肿瘤组织与13个邻近组织配对。结果表明，诊断模型获得了92%的灵敏度和92%的特异性。(图8e，f)。

为了更好地区分肝癌和肝结节，作者也建立了一个诊断模型。诊断评分确定如下:logit(P = HCC)= 45.308+0.628×PDSS 1表达水平+ 8.452 × SLC7A11表达水平+ 4.047 × CDCA8表达水平。在GSE6764和GSE89377队列中测试了模型的诊断性能。一个达到88.57%的灵敏度和82.35%的特异性，另一个达到87.5%的灵敏度和77.27%的特异性(图9a，c)。GSE6764和GSE89377的AUC分别为0.934和0.935(图9b，d)。这些数据进一步证实，该诊断模型是一种新的预测工具，具有较高的准确性和潜在的临床价值。

图8

图9

8. 基因表达、遗传改变和独立预后分析的验证

从cBioportal数据库中检测到三个基因的遗传改变，发现PDSS1、SLC7A11和CDCA8具有9%、3%和5%的遗传改变(图10a)。在TCGA的50个肿瘤样本和50个正常样本中发现这三个基因在HCC都高度表达(图10b–d)。在HCC临床样本中每个基因的mRNA表达的评估显示其在肿瘤中高表达 (图10e-g)。此外作者还检测了这三种基因在正常肝细胞和不同肝癌细胞系中的表达。结果表明PDSS1、SLC7A11和CDCA8在肝癌细胞系中显著上调 (图10h-j)。通过分析GSE6764队列中的基因表达发现PDSS1、CDCA8和SLC7A11在肿瘤组织中的表达水平明显高于在肝脏结节中的表达水平(图10k–m)。相关性分析（图10o-q）显示CDCA8、PDSS1、SLC7A11之间存在某种协同作用。生存分析结果显示，PDSS1、CDCA8、SLC7A11的高表达水平分别与较短的总存活时间相关(图11a-c)。此外，无进展生存期(PFS)分析显示单个基因的表达水平和疾病进展之间的联系(图11d-f)。基因集富集分析显示这些基因富集在免疫相关途径，如JAK-stat 3信号，NF-κB信号 (图11g-I)。

图10

图11

9. 高危人群和低危人群免疫微环境的比较

由于这三个基因在某些免疫途径中被发现富集，因此作者分析了HCC缺氧相关基因与免疫细胞浸润和免疫检查点之间的关系。高危组患者的M0巨噬细胞、记忆B细胞和卵泡辅助T细胞的比例高于低危组 (图12a-c)。此外，高风险组TIM3、B7H3、CTLA4、PD1和PDL1的表达水平明显高于低风险组（图12d-h)。因此说明肿瘤免疫微环境可能是缺氧相关基因高表达的HCC患者预后诊断的标识。

图12

结语

这篇文章的篇幅很长，但分析方法还是比较中规中矩。通常我们对得到的预后特征基因构建完模型后就截止了，但本文却对这些基因进行了进一步的分析，研究这些基因在诊断和复发模型中的作用，取得了不错的结果，免疫浸润分析更是增光添彩，文章思路值得借鉴！

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