单细胞分析揭示了葡萄膜黑色素瘤新的进化复杂性

文章概述

文章标题：《Single-cell analysis reveals new evolutionary complexity in uveal melanoma》

发表日期和杂志：2020年发表在Nature Communications上

在线阅读链接：https://doi.org/10.1038/s41467-019-14256-1

uveal melanoma简介

葡萄膜黑色素瘤(UM)是一种高度转移性癌症，与皮肤黑色素瘤不同，它对检查点免疫治疗基本没有反应。

让BioinfoArk提供的中国区chatGPT简单介绍了一下这个疾病

葡萄膜黑色素瘤（Uveal melanoma，UM）是一种罕见但具有高度转移性的眼部肿瘤。它起源于葡萄膜，即眼球的中层组织，通常发生在虹膜、睫状体和脉络膜。与皮肤黑色素瘤不同，UM的发病机制和治疗方法有所不同。

UM通常在中年人中发病，尤其是白种人。其病因尚不完全清楚，但一些遗传和环境因素可能与其发生有关。常见的症状包括视力模糊、眼球疼痛、眼球红肿、视野缺损等。早期诊断和治疗对于预防UM的转移至其他器官至关重要。

UM的治疗方法包括手术切除、放疗和局部治疗。然而，UM对传统的化疗和放疗方法不太敏感，且易于转移至肝脏等远处器官，导致预后不佳。近年来，免疫疗法和靶向治疗等新的治疗方法也在UM的研究中得到关注。

单细胞实验设计

使用单细胞RNA测序技术对8个原发性和3个转移性样本中的59,915个肿瘤和非肿瘤细胞进行了单细胞分辨率的肿瘤微环境研究

单细胞转录组数据情况

数据链接是：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE139829

可以看到是11个样品：

 
GSM4147091 BSSR0022_single cell RNAseq
GSM4147092 UMM041L_single cell RNAseq
GSM4147093 UMM059_single cell RNAseq
GSM4147094 UMM061_single cell RNAseq
GSM4147095 UMM062_single cell RNAseq
GSM4147096 UMM063_single cell RNAseq
GSM4147097 UMM064_single cell RNAseq
GSM4147098 UMM065_single cell RNAseq
GSM4147099 UMM066_single cell RNAseq
GSM4147100 UMM067L_single cell RNAseq
GSM4147101 UMM069_single cell RNAseq

作者给出来的数据是每个样品都是标准的10X单细胞的数据格式，有barcodes.tsv.gz、genes.tsv.gz和matrix.mtx.gz三个文件：

下载数据之后我们可以按照不同的样品名进行一个简单的整理，然后再读取它们：

#按样品名整理数据
fs=list.files('./','genes.tsv.gz')
fs
samples1=gsub('genes.tsv.gz','',fs)
samples1
library(stringr)
samples2=str_split(samples1,'_',simplify = T)[,2]
samples2 

lapply(1:length(samples2), function(i){
  #i=1
  x=samples2[i]
  y=samples1[i]
  dir.create(x,recursive = T)
  file.copy(from=paste0(y,'genes.tsv.gz'),
            to=file.path(x,  'features.tsv.gz' )) 
  file.copy(from=paste0(y,'matrix.mtx.gz'),
            to= file.path(x, 'matrix.mtx.gz' ) ) 
  file.copy(from=paste0(y,'barcodes.tsv.gz'),
            to= file.path(x, 'barcodes.tsv.gz' )) 
  
})

#加载R包读取数据
rm(list=ls())
options(stringsAsFactors = F)
library(Seurat)
library(stringr)
library(data.table)

samples=list.files('outputs/')
samples

# Should show barcodes.tsv.gz, features.tsv.gz, and matrix.mtx.gz

sceList = lapply(samples,function(pro){ 
  #pro=samples[1]
  folder=file.path('outputs',pro ) 
  print(pro)
  print(folder)
  print(list.files(folder))
  print( Sys.time() )
  sce=CreateSeuratObject(counts = Read10X(folder), 
                         project = pro )
  print( Sys.time() )
  return(sce)
})

as.data.frame(sce.all@assays$RNA@counts[1:10, 1:2])
head(sce.all@meta.data, 10)
table(sce.all@meta.data$orig.ident) 

后面就是标准分析啦,对读取进来的数据进行质控、harmony整合以及细分亚群等。

第一层次降维聚类分群

使用t分布随机相邻嵌入(t-SNE)的降维分析揭示了肿瘤和非肿瘤细胞类型的多样性

文章中给出来的分群主要也是：

• Class 1 PRAME-tumor cells
• Class 1 PRAME+tumor cells
• Class 2 PRAMEtumor cells
• Class 2 PRAME+tumor cells
• Monocytes & macrophages
• T cells
• NK cells
• B cells
• RPE cells
• Endothelial cells
• Plasma cells
• Photoreceptor cells
• Fibroblasts

所以文章针对这些细胞进行了一个细胞亚群分类，我们通过BioinfoArk提供的中国区chatGPT查询到各个细分亚群的解释：

• Class 1 PRAME-tumor cells：没有PRAME表达的肿瘤细胞。
• Class 1 PRAME+tumor cells：表达PRAME的肿瘤细胞。
• Class 2 PRAMEtumor cells：PRAME表达的另一类肿瘤细胞。
• Class 2 PRAME+tumor cells：同时表达PRAME和其他特定标记物的肿瘤细胞。
• Monocytes & macrophages：单核细胞和巨噬细胞，是免疫系统中的重要成分，参与免疫应答和炎症调节。
• T cells：T细胞，一种免疫细胞，主要负责识别和杀伤感染的细胞和肿瘤细胞。
• NK cells：自然杀伤细胞，一种免疫细胞，能够直接杀伤病原体感染的细胞和肿瘤细胞。
• B cells：B细胞，一种免疫细胞，主要负责产生抗体以对抗感染。
• RPE cells：视网膜色素上皮细胞，位于视网膜下方，起到维持视网膜健康和光感受的作用。
• Endothelial cells：内皮细胞，构成血管内壁，参与血管的构建和调节。
• Plasma cells：浆细胞，是B细胞的一种分化形式，主要负责产生和分泌抗体。
• Photoreceptor cells：光感受细胞，位于视网膜中，负责转换光信号为神经信号。
• Fibroblasts：成纤维细胞，一种结缔组织细胞，参与修复和重建组织的过程。

其它加分项

在包含经过验证的GEP临床预后测试的12个基因中，有5个基因在肿瘤细胞中主要表达(EIF1B、HTR2B、ECM1、CDH1和ROBO1)，但1个主要表达于T细胞(SATB1)，其余6个基因在肿瘤细胞和免疫细胞中均表达

基因表达谱

使用Monocle 2分析了scRNA-seq数据，该数据重建了假定的分支转录轨迹，以确定计算状态之间的潜在关系。发现所有肿瘤细胞的伪时间排序产生了总共16个状态，组织成两个主要分支，根据GEP 1类和2类进行自分类。

文章发现浸润肿瘤的免疫细胞包括以LAG3为主要表达检查点标记物的CD8+ T细胞，而不是PD1或CTLA4。V(D)J分析显示克隆扩增的T细胞，表明它们能够产生免疫应答。来自1B类UM的慢性肝转移病例中浸润有克隆扩增的浆细胞，表明存在抗体介导的免疫。肿瘤和免疫细胞之间的这种复杂生态系统为我们提供了对UM生物学的新见解，并确定LAG3作为高危UM患者免疫检查点阻断的潜在候选药物。